靶向革兰氏阳性病原体DNA聚合酶PolC的独特抑制剂构象解析：为新型抗生素研发提供结构基础

《Nature Communications》：A unique inhibitor conformation selectively targets the DNA polymerase PolC of Gram-positive priority pathogens

语 本研究针对抗生素耐药性革兰氏阳性病原体（如MRSA、VRE和艰难梭菌）的威胁，通过冷冻电镜技术解析了首创抗生素ibezapolstat（IBZ）及新型抑制剂ACX-801与肠球菌PolC聚合酶的复合物结构。研究发现抑制剂通过非平面构象诱导形成结合口袋，并与模板DNA链的dCMP碱基配对，从而竞争性抑制dGTP掺入。关键残基苯丙氨酸1276（F1276）被确定为耐药性热点，该成果为理性设计针对PolC的下一代抗生素奠定了结构基础。

　　

抗生素耐药性病原体的蔓延已成为全球公共卫生的重大挑战，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）和艰难梭菌（Clostridioides difficile）等革兰氏阳性优先病原体引起的感染。现有抗生素的失效迫使科学界寻找作用于新靶点的抗菌药物。细菌DNA复制机制中的关键酶——DNA聚合酶PolC，作为一种原核生物特有的C家族聚合酶，因其与真核生物聚合酶的结构差异，成为极具潜力的选择性抗菌靶点。

在此背景下，靶向PolC的抑制剂ibezapolstat（IBZ）作为首创新药，已进入治疗艰难梭菌感染（CDI）的III期临床试验阶段。然而，其分子作用机制一直未被阐明。同时，为提高药物溶解性和系统给药效果，研究者开发了IBZ的衍生物ACX-801。发表于《Nature Communications》的这项研究，首次通过高分辨率结构生物学手段，揭示了这些抑制剂与PolC的作用模式，为开发针对多重耐药革兰氏阳性菌的新一代抗生素提供了关键见解。

关键技术方法概述

研究团队采用冷冻电镜（cryo-EM）解析了粪肠球菌（Enterococcus faecium）PolC与DNA底物及抑制剂IBZ或ACX-801复合物的三维结构。通过体外生化实验（包括实时荧光淬灭法测定IC₅₀和凝胶阻滞法分析聚合酶/核酸外切酶活性）评估了抑制剂对PolC及其突变体的抑制效果。利用肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），并通过一步法耐药性筛选和全基因组测序鉴定了与耐药性相关的polC基因突变。此外，在艰难梭菌模型菌株中通过质粒互补实验验证了关键耐药位点的保守性。

研究结果

PolC抑制剂的选择性抗菌活性

IBZ和ACX-801均对革兰氏阳性病原体（如VRE、MRSA和PRSP）表现出强效抑制作用（MIC为1-8 mg/L），但对大肠杆菌等革兰氏菌无活性。实时聚合酶活性测定显示，ACX-801对PolC的抑制活性（IC₅₀ = 5.8 μM）优于IBZ（IC₅₀ = 12.3 μM），且对DnaE型聚合酶无明显抑制，体现了其高选择性。

抑制剂诱导的独特结合口袋

冷冻电镜结构显示，IBZ和ACX-801的鸟嘌呤类似物基团与DNA模板链的dCMP形成碱基配对，模拟dGTP的结合模式。其创新性在于，抑制剂的N2取代芳香基团（如IBZ的3,4-二氯苄基）以约90°的非平面构象弯曲，诱导PolC形成一个由H1185、F1276、H1280和Y1284四个芳香残基构成的疏水口袋。在apo状态（无抑制剂结合）下，该口袋被F1276阻塞，结合抑制剂后F1276发生位移，形成“诱导契合”效应。

F1276是耐药性关键热点

耐药性筛选实验发现，F1276的突变（如F1276L/I/S）会导致对IBZ和ACX-801的交叉耐药（MIC升高≥32倍）。体外酶活实验证实，F1276L和F1276S突变显著降低抑制剂敏感性（IC_{50增加8-48倍），而聚合酶活性未受严重影响。在艰难梭菌中引入等效突变F1258L同样导致MIC显著上升，表明该位点在革兰氏阳性菌中高度保守且功能关键。}

讨论与意义

本研究首次在原子水平揭示了PolC抑制剂通过非平面构象诱导结合口袋的分子机制，阐明了其选择性抑制革兰氏阳性菌聚合酶的基础。关键残基F1276的鉴定为监测临床耐药性提供了生物标志物，而ACX-801与IBZ结构的相似性提示该机制可能普适于此类抑制剂。尽管部分耐药突变（如A1281T）可能伴随酶活性下降，但IBZ在肠道中达到的高浓度（>1000 μg/g粪便）可能有效抑制耐药菌株生长。

综上所述，该研究通过整合结构生物学、遗传学和生化手段，为理性设计高效、低耐药性的PolC靶向抗生素奠定了坚实基础，对应对革兰氏阳性耐药菌感染这一全球性挑战具有重要推动意义。