亲和捕获冷冻电子断层扫描技术揭示淋巴细胞外基质细丝结构及其纳米尺度解析

《Nature Communications》：Extracellular filaments revealed by affinity capture cryogenic-electron tomography

本研究针对非贴壁细胞（如T细胞）在冷冻电子断层扫描（cryo-ET）样品制备中的定位难题，开发了一种基于抗体微图案化的亲和捕获系统。通过将抗CD3抗体微图案化于电镜载网，成功捕获并精确定位Jurkat T细胞，实现了高效冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）减薄和原位cryo-ET成像。研究发现细胞表面存在直径约10 nm的细丝状结构，经RNA测序和流式细胞术验证提示为波形蛋白（vimentin）组成的中间丝。该技术为研究纳米尺度细胞表面结构提供了新方法，对免疫细胞功能研究具有重要意义。

　　

在细胞生物学研究领域，揭示细胞纳米尺度结构一直是科学家追求的目标。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术结合了细胞的低温保存和电子断层扫描，为观察细胞内部结构提供了前所未有的高分辨率视角。然而，该技术在应用过程中面临一个关键挑战：如何将细胞精确地定位在电镜载网的理想位置，以便进行后续的冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）减薄和数据采集。这一挑战在非贴壁细胞（如免疫细胞）中尤为突出，因为这些细胞在载网上分布不均匀，往往形成团块，影响玻璃化冰质量和FIB减薄效果。

传统方法使用细胞外基质蛋白微图案化来定位贴壁细胞，但对于像T细胞这样的非贴壁细胞，这种方法效果有限。淋巴细胞在机体抵抗感染和癌症中发挥关键作用，虽然荧光成像和常规电子显微镜技术增进了我们对淋巴细胞功能的理解，但前者受限于光波长，后者需要固定和染色步骤，可能破坏精细的生物学结构。因此，开发能够精确定位非贴壁细胞并进行高分辨率成像的新方法，对推动细胞生物学研究具有重要意义。

针对这一难题，斯坦福大学和以色列理工学院的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究，开发了一种亲和捕获系统，通过将抗体微图案化于电镜载网，成功捕获并精确定位人T细胞和Jurkat细胞（一种永生化人T淋巴细胞系）。这一技术不仅提高了工作流程效率，还首次在细胞外空间揭示了纳米尺度的细丝状结构。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，在300目金载网上进行微图案化处理，使用抗CD3抗体功能化不同尺寸（5-30μm）的圆形图案；其次，通过亲和捕获技术将Jurkat细胞和原代T细胞精确定位在载网方孔中心；然后利用 plunge-freezing 进行玻璃化冰处理，并通过cryo-FIB减薄至目标厚度175 nm；最后进行cryo-ET数据采集和三维重构，结合RNA测序和流式细胞术对观察到的结构进行验证。

亲和捕获系统优化细胞定位

研究团队评估了在电镜载网上捕获非贴壁细胞系的可行性。他们将T细胞特异性抗人CD3抗体微图案化，用于捕获Jurkat细胞。亲和捕获载网成功捕获单个Jurkat细胞并将其精确定位在载网方孔中心（图1a-c）。细胞定位仅限于用抗CD3抗体处理的电镜载网上的微图案化区域。对照条件（无抗体或非特异性抗体）在冲洗后均未检测到细胞。

Jurkat细胞占据特定载网方孔的数量随着微图案化抗体岛尺寸的增大而增加（图2）。约为Jurkat细胞一半大小（即5μm）的微图案化岛无法捕获细胞。圆形微图案化抗CD3岛最适合Jurkat细胞的玻璃化冰处理和cryo-FIB/扫描电镜观察。典型的亲和捕获载网含有足够数量的精确定位单个细胞，可满足常规手动cryo-FIB会话的需求（>10个）。单个Jurkat细胞的cryo-FIB减薄目标厚度（175 nm）容易实现。

细胞外细丝结构的发现

对cryo-FIB减薄后的薄片进行cryo-ET分析，揭示了Jurkat细胞内部和外部的细胞特征。虽然Jurkat细胞在光学显微镜和冷冻扫描电镜下呈现光滑圆形外观，但在cryo-ET断层图重建中，细胞外围揭示了细胞外细丝状结构（图3-5）。这些细丝仅在薄片的尾部边缘观察到，该区域捕获了Jurkat细胞与微图案化载网SiO₂表面之间的界面。

在重建的断层图中，细丝从细胞的质膜发出。细丝的外部直径约为10 nm，表观内径约为3 nm，处于中间丝的范围。这些细胞外细丝具有电子透明的腔室，似乎由4个原纤维组成。虽然从冷冻断层图中无法确定细丝的长度，但它们可能达到微米级，因为其横穿整个断层图视野，并在中等放大蒙太奇图像中形成广泛的网状结构。

细胞外细丝在靠近细胞表面处形成准随机未连接网络，但也形成至少2至7根细丝的膜状束，在接触细胞之间的区域尤为突出。细胞间细丝束中细丝的较短距离（8.6 nm±0.124）与向细胞外环境开放的束中细丝（12.49 nm±0.622）相比，表明这些结构是可压缩的。断层图分割还揭示了核膜、囊泡结构和质膜。

细丝结构的分子鉴定

断层图中丰富的细丝使得能够利用低剂量倾斜图像选取和比对细丝，重建cryo-ET图谱（图6）。尽管CryoSPARC重建产生了有纹理的图谱（可能表明过拟合），但中间丝的整体结构明显，直径约为100?，由相互交错的片段组成。这表明蛋白质的平行排列具有长的束状α螺旋，类似于最近聚合波形蛋白中间丝的7.2?冷冻电镜图谱。

由于cryo-ET图谱的分辨率（10.8?）不足以鉴定细丝的组成蛋白，进行了RNA测序以确定Jurkat细胞和对照人胚胎肺成纤维细胞中间丝基因的转录水平。在71个中间丝蛋白相关基因中，只有两个I/II型（KRT1和KRT10）和一个III型（VIM）基因表达丰富（>100标准化读数），而HELF对照有八个I/II/III型基因。

通过流式细胞术在非渗透化（表面）和渗透化（总）Jurkat细胞的外表面检测到波形蛋白。与无抗体或同型对照相比，在几乎所有（>98%）渗透化和非渗透化Jurkat细胞中检测到波形蛋白。此外，在固定前用同型对照、抗CD4或抗CD3抗体孵育Jurkat细胞不会改变总波形蛋白和细胞表面波形蛋白的水平。活细胞流式细胞术显示，活Jurkat细胞波形蛋白阴性，而65°C处理5分钟且DAPI可渗透（死亡）的细胞几乎全部波形蛋白阳性。固定导致细胞大小增加，而活/死染色表明这不是由于细胞死亡，而是固定本身所致。

研究意义与展望

该研究开发的亲和捕获系统能够准确、重复地将淋巴细胞定位在电镜载网上，用于cryo-FIB减薄和cryo-ET研究。除了定位细胞和限制附着到基底特定区域的细胞数量外，使用抗体、配体和细胞外基质蛋白功能化的微图案化岛有可能从多样化细胞群中选择和捕获目标细胞类型。或者，可以在同一载网方孔内图案化两种不同抗体以捕获不同细胞类型，用于共培养研究。

研究人员观察到Jurkat细胞表面存在纳米尺度细丝，其尺寸（10 nm）均匀且与中间丝一致。细丝位于细胞质膜外，排除了是糖萼的可能性，因为糖萼具有广泛互连的网络和广泛的细丝直径分布（3至15 nm）。cryo-ET图谱中的延伸结构，加上基因表达水平高，以及固定后通过流式细胞术在细胞外表面检测到波形蛋白，支持波形蛋白是观察到的Jurkat细胞外空间细丝网络的可能组成部分。

据研究人员所知，天然中间丝网络以前从未在细胞外空间以纳米尺度观察到。这些长且无膜投射如何从细胞中出现仍不清楚。尽管传统电子显微镜模态可以提供比光学显微镜更高的分辨率，但与原位cryo-ET相比，它们需要可能引起细胞表面细丝网络等精细结构崩溃的制备步骤。cryo-ET克服了这些破坏性处理方法的局限性，提供了保存在水合、近天然状态细胞的最高分辨率成像。

亲和捕获系统提高了样品可用性，减少了制备用于cryo-FIB/cryo-ET的细胞样品所需的成本和准备时间。适当包装的亲和捕获电镜载网可以帮助非专家（如缺乏电镜经验的临床医生）制备和运送临床相关细胞至cryo-EM设施进行cryo-ET成像。设计提高微图案化电镜载网保质期的储存方法是未来增加亲和捕获电镜载网可及性的重要研究方向。