沙门氏菌SPI-2效应蛋白多突变体策略揭示肠道炎症和系统定植的新机制

《Nature Communications》：Salmonella multimutants enable efficient identification of SPI-2 effector protein function in gut inflammation and systemic colonization

本研究针对沙门氏菌SPI-2型III分泌系统效应蛋白功能冗余和技术挑战，构建了六组功能分类的多突变体。通过体内感染模型发现，细胞内复制相关效应蛋白群对系统感染至关重要，而SopD2和GtgE效应蛋白协同介导SPI-2依赖性肠道炎症。该研究为病原体-宿主互作机制研究提供了新范式。

　　

在微生物致病机制研究领域，沙门氏菌作为典型胞内病原体，其致病性高度依赖于两种III型分泌系统（T3SS）。其中位于沙门氏菌致病岛2（SPI-2）的T3SS负责在细菌进入宿主细胞后调控细胞内生存环节。然而，SPI-2系统可转运超过30种效应蛋白，这些蛋白功能存在显著冗余与互作关系，使得传统单基因敲除策略难以揭示单个效应蛋白的具体功能。这一技术瓶颈严重制约了人们对沙门氏菌致病机制的深入理解。

针对这一挑战，苏黎世联邦理工学院微生物研究所的Joshua P. M. Newson等研究人员在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。团队通过理性设计构建了六株SPI-2效应蛋白多突变体菌株，系统阐明了不同效应蛋白群在肠道炎症和系统感染中的功能分工，并发现了SopD2和GtgE效应蛋白在介导肠道炎症中的关键协同作用。

研究采用的主要技术方法包括：基于λ-Red同源重组的基因敲除技术、P22噬菌体转导技术、Flp-FRT重组系统、小鼠腹腔和口服感染模型、竞争性感染实验、组织病理学分析、脂钙蛋白2（LCN-2）ELISA检测、全基因组测序验证等。实验使用C57BL/6J小鼠作为感染模型。

构建和验证SPI-2效应蛋白多突变体菌株

研究人员根据已报道的功能将SPI-2效应蛋白分为五大类群，通过理性设计构建了六株多突变体菌株（命名为Alpha至Zeta）。

采用P22噬菌体转导和Flp-FRT系统逐步敲除3-6个效应蛋白基因，并通过全基因组测序验证了突变体构建的正确性。

SPI-2效应蛋白群促进系统感染

通过腹腔感染模型发现，缺失细胞内复制相关效应蛋白（Alpha群）、宿主防御调控相关效应蛋白（Delta群）和毒力质粒效应蛋白（Zeta群）的突变体在肝脏和脾脏的定植能力显著降低，而缺失其他效应蛋白群（Beta、Gamma、Epsilon）的突变体表型与野生型相似。竞争性感染实验进一步验证了这些效应蛋白群在系统感染中的重要性。

SPI-2效应蛋白支持细菌从肠道迁移至系统部位

口服感染实验表明，Alpha和Zeta突变体在系统部位的细菌载量降低，而Delta突变体的表型与SPI-2 T3SS组装缺陷株相似。这些效应蛋白群对细菌从肠道向系统部位的迁移至关重要，但对肠道定植的影响较小。

SPI-2 T3SS驱动的肠道炎症需要特定效应蛋白群

在SPI-1 T3SS缺陷背景下，研究人员发现Alpha和Delta效应蛋白群的缺失显著降低了SPI-2依赖性肠道炎症。组织病理学分析显示，这些效应蛋白群对肠道病理损伤的形成具有重要贡献。

迭代删除效应基因识别介导肠道炎症的关键SPI-2效应蛋白

通过逐步简化突变策略，研究人员发现SopD2和GtgE效应蛋白的协同缺失足以重现Delta多突变体的表型。进一步实验证实，这两个效应蛋白通过调控宿主GTP酶Rab32的活性，在介导SPI-2依赖性肠道炎症中发挥关键作用。

本研究通过创新性的多突变体策略，成功克服了沙门氏菌SPI-2效应蛋白功能研究的传统技术障碍。研究发现不同效应蛋白群在系统感染和肠道炎症中具有明确的功能分工，其中SopD2和GtgE效应蛋白的协同作用对肠道炎症的诱导尤为关键。这些发现不仅深化了对沙门氏菌致病机制的理解，也为研究其他多效应蛋白病原体的致病机制提供了可借鉴的技术路线。该研究建立的多突变体资源和技术平台，将为未来病原体-宿主互作研究提供重要工具和理论基础。