昼夜节律生物标志物调控治疗性蛋白释放的合成生物学新策略

《Nature Communications》：Regulation of therapeutic protein release in response to circadian biomarkers

本研究针对慢性疾病治疗中药物释放与生理节律脱节的问题，开发了一种基于褪黑素受体MTNR1A的昼夜节律感应基因开关。研究人员通过工程化改造哺乳动物细胞，使其能够感知夜间升高的内源性褪黑素水平，并通过cAMP-CREB信号通路精准调控GLP-1等治疗蛋白的夜间特异性分泌。在糖尿病模型小鼠中，该系统成功实现血糖稳态的节律性恢复，为肥胖相关代谢疾病的个性化时序疗法提供了新范式。

　　

在慢性疾病治疗中，传统给药方式往往忽视人体内在的生物节律，导致疗效受限或副作用增加。以糖尿病为例，当前主流的GLP-1类似物虽能有效控糖，但需频繁注射且无法模拟生理性脉冲分泌。自然界中，生物体通过昼夜节律钟协调激素分泌与代谢过程，如褪黑素（melatonin）夜间显著升高、白天处于低水平。能否利用这种内源性节律信号，设计一种"智能"细胞疗法，实现治疗蛋白的按需释放？瑞士苏黎世联邦理工学院和西湖大学团队在《Nature Communications》发表的研究给出了肯定答案。

本研究通过合成生物学手段，构建了一种褪黑素诱导的基因表达系统。核心策略是利用人体固有的G蛋白偶联受体MTNR1A作为传感器，将其与cAMP响应元件（CRE）调控的合成启动子偶联。当夜间褪黑素水平升高时，受体激活细胞内cAMP-PKA-CREB信号级联，驱动下游治疗蛋白表达。该系统仅响应夜间生理浓度（100-700 pM）的褪黑素，白天保持静默，展现出良好的时间分辨能力。

关键技术方法包括：GPCR筛选与信号通路正交性验证、启动子组合优化（如mPGK驱动MTNR1A与P_cAMP控制报告基因）、Sleeping Beauty转座子系统构建单克隆细胞株、藻酸盐-聚赖氨酸微胶囊封装细胞移植技术，以及使用C3H/HeJ（内源性褪黑素正常）和C57BL/6J（褪黑素缺陷）小鼠模型验证节律调控功能。

设计哺乳动物昼夜节律感应响应系统

研究人员筛选了多种昼夜节律相关受体，发现MTNR1A在HEK293T细胞中具有低本底、高诱导性的优势。相较于TSH受体，MTNR1A介导的系统在100 nM褪黑素刺激下可产生40倍以上的SEAP报告基因诱导表达，且特异性通过cAMP通路发挥作用。

优化褪黑素响应型转录开关

通过系统筛选MTNR1A表达启动子（SV40、CMV、mPGK、EF1α）与CRE启动子变体的组合，发现mPGK启动子驱动MTNR1A联合pVH421报告质粒时，既能保证高蛋白表达量，又可实现最佳诱导倍数。该配置使系统灵敏度达100 pM，与人体夜间褪黑素峰值吻合。

表征褪黑素响应系统

该系统在CHO、hMSC等多种哺乳动物细胞中均有效，且可被拉米替隆等临床批准的MTNR1A激动剂激活。稳定转染的单克隆细胞系（C16）展示出可逆的调控特性：在褪黑素存在时6小时内启动表达，撤除后恢复静默状态。将执行模块替换为GLP-1后，工程化细胞（HEK_GLP-1）在夜间生理浓度褪黑素刺激下分泌超过100 pM的活性GLP-1。

体内验证褪黑素诱导的GLP-1分泌

微胶囊包裹的HEK_GLP-1细胞植入小鼠体内后，可准确响应内源性褪黑素节律：C3H/HeJ小鼠在黑暗环境中夜间GLP-1分泌量显著高于持续光照组。在褪黑素缺陷的C57BL/6J模型中，口服外源性褪黑素可剂量依赖性激活GLP-1分泌。在db/db糖尿病模型中，该系统通过夜间特异性GLP-1释放使空腹血糖恢复正常水平，且血药浓度始终高于50 pM的有效阈值。

该研究首创性地将内源性昼夜节律信号转化为治疗蛋白表达的调控开关，解决了基因疗法中时序控制的关键难题。系统兼具"闭环"（响应生理节律）和"开环"（响应外源药物）控制优势，且模块化设计允许替换其他治疗蛋白（如抗体、促红细胞生成素）。尽管人体褪黑素水平随年龄下降可能限制应用，但临床批准的MTNR1A激动剂（如阿戈美拉汀）可作为替代诱导剂。这项工作为代谢疾病、睡眠障碍及相关慢性病的时序疗法提供了新思路，同时也可作为药物筛选和节律生物学研究的工具平台。