人源Coronin 7通过结合Arp2/3复合体与肌动蛋白丝促进分支解离的机制及其在内质网-高尔基体运输中的作用

《Nature Communications》：Mechanism of Arp2/3 complex branch disassembly by human Coro7

本研究揭示了人源Coronin 7（Coro7）作为Arp2/3复合体分支解离因子的新机制。通过冷冻电镜和生化分析，发现Coro7的中央酸性结构域（CA）以~1μM亲和力结合游离Arp2/3复合体的Arp3亚基，虽像Arpin一样抑制聚合，但像WASP家族NPFs一样促进活性短螺距构象。然而，全长Coro7不抑制聚合，而是有效诱导去分支，这一过程需要其所有结构域协同作用。细胞实验中，Coro7缺失破坏ER-Golgi运输，可被全长而非截短变体挽救。这些结果表明Coro7是Arp2/3复合体分支解离因子，参与肌动蛋白依赖的ER-Golgi运输。

　　

在细胞的生命活动中，肌动蛋白细胞骨架的动态重组是驱动细胞运动、胞内运输等过程的核心。其中，Arp2/3复合体（Arp2/3 complex）作为关键的成核因子，能在已有的肌动蛋白丝（母亲丝）侧面启动新的分支丝（女儿丝）形成，从而构建复杂的分支肌动蛋白网络。然而，如同城市交通需要建设也需要疏通，这些分支网络的形成与及时解离（即去分支，debranching）对于维持细胞正常的形态与功能至关重要。目前已知多种调控因子：WASP家族成核促进因子（NPFs）激活Arp2/3复合体；Cortactin稳定分支连接；而Arpin和GMF等则分别抑制成核或促进去分支。Coronins蛋白家族在体外可抑制Arp2/3复合体，在细胞中则表现出促进去分支的活性，但其成员Coro7（Coronin 7）由于结构域组成特殊（含有两个β-螺旋桨结构域β1β2和C端中央酸性结构域CA，缺乏三聚化卷曲螺旋域），其功能机制一直不甚清晰。先前研究提示Coro7与高尔基体相关，可能参与囊泡运输，但其是否以及如何调控Arp2/3复合体分支动力学，仍是未解之谜。

为了阐明人源Coro7调控Arp2/3复合体的结构-功能机制，研究人员在《Nature Communications》上发表了这项研究。他们综合运用了多种关键技术方法：包括蛋白质生化分析（如吡啶-肌动蛋白聚合实验、等温滴定量热法ITC、交联实验、肌动蛋白共沉降实验）、冷冻电镜（Cryo-EM）结构解析（分辨率达3.0 ?，揭示了Coro7 CA与Arp2/3复合体的结合模式）、微流控技术与全内反射荧光显微镜（Microfluidics-TIRF microscopy）直接可视化观察分支解离动力学、以及细胞生物学实验（利用CRISPR/Cas9构建Coro7基因敲除（KO）细胞系，结合RUSH系统实时追踪GFP-GPI报告蛋白从内质网到高尔基体的运输过程，并通过蛋白质电穿孔技术回补纯化的Coro7蛋白变体进行功能挽救实验）。

Coro7 CA抑制Arp2/3复合体介导的聚合而Coro7 FL则不抑制

研究人员首先通过吡啶-肌动蛋白聚合实验评估了不同Coro7构建体（全长FL、β1β2、CA）对Arp2/3复合体活性的影响。结果发现，与I型和II型coronins不同，Coro7 FL和β1β2均不显著抑制N-WASP WCA激活的Arp2/3复合体聚合。相反，单独的Coro7 CA结构域则表现出强烈的抑制活性，在1μM浓度下其抑制效果甚至比已知抑制剂Arpin CA强一倍。这表明Coro7 CA具有抑制Arp2/3复合体的潜能，但这种抑制活性在全长蛋白中被掩盖。

Coro7 CA以1:1化学计量结合Arp2/3复合体并促进短螺距构象

ITC实验表明，Coro7 CA以约1μM的亲和力与ATP或ADP状态的Arp2/3复合体以1:1化 stoichiometry 结合。通过交联实验分析Arp2/3复合体构象，发现Coro7 CA与N-WASP WCA类似，能促进Arp2-Arp3交联带的形成，表明其促进了Arp2/3复合体向活性短螺距构象的转变，这与抑制性蛋白Arpin CA的作用相反。

Coro7 CA在Arp3上的结合位点与NPFs、Arpin和Cortactin共享

研究人员解析了人源Coro7 CA与牛脑Arp2/3复合体结合的3.0 ?分辨率冷冻电镜结构。结构显示，Coro7 CA的38个氨基酸（D889-D925）结合在Arp3亚基的单个位点。其中央结构域（Coro7 C）是一个两亲性α螺旋，插入Arp3 barbed末端的疏水裂隙，并像NPFs一样 displaces Arp3的自抑制C端尾部。其酸性结构域（Coro7 A）则沿Arp3亚结构域3和4结合，其保守的色氨酸W924结合在由Arp3残基R329-R341和Y233-K244形成的口袋中。该结合位点与WASP家族NPFs、Arpin和Cortactin的酸性结构域共享，表明这些调控因子可能竞争结合Arp3。结构分析解释了为何Coro7 CA既能像Arpin一样竞争性抑制NPF结合，又能像NPFs一样促进短螺距构象。

Coro7 FL解离Arp2/3复合体分支

肌动蛋白共沉降实验表明，Coro7的β-螺旋桨结构域（FL, β1β2, β1, β2）能以微摩尔级亲和力结合F-肌动蛋白，但β1和β2在FL蛋白中对F-肌动蛋白结合的贡献并非简单加和，提示其结合面可能在蛋白内部被部分遮蔽。更重要的是，Coro7 FL对ADP状态的F-肌动蛋白亲和力高于ADP-BeF₃状态（模拟ADP-Pi状态），提示其可能靶向Pi释放后的较老分支。通过微流控-TIRF显微镜直接观察分支解离过程，发现全长Coro7（Coro7 FL）能有效加速分支解离，其过程符合双指数动力学，表明存在Coro7依赖性和非依赖性的两条解离路径。Coro7 FL与分支连接的表观亲和力约为30 nM。截短体Coro7β2CA具有一定去分支活性但较弱，而缺乏CA或β2结构域的构建体（β1β2或CA）则无此活性。这表明Coro7作为去分支因子而非抑制剂的功能需要其所有结构域的协同作用。

Coro7缺失破坏内质网-高尔基体运输

利用RUSH系统在Coro7基因敲除（KO）的RPE-1细胞中实时追踪GFP-GPI报告蛋白从ER到高尔基体的运输，发现KO细胞中GFP-GPI在高尔基体凝聚的时间显著延迟。通过电穿孔引入与内源水平相当的纯化Flag-iRFP标记的Coro7蛋白变体，发现全长Coro7（FL）能挽救此运输缺陷，而截短变体β1β2和β2CA则不能。此外，在MCF10A细胞中，Coro7缺失导致与分支肌动蛋白网络标记物cortactin在高尔基周边区域共定位的信号增强，这与去分支活性降低的预期一致。这些结果将Coro7的去分支功能与其在ER-Golgi运输中的生理作用直接联系起来。

综上所述，本研究阐明了人源Coro7作为Arp2/3复合体分支解离因子的新颖机制。其独特之处在于：虽然其分离的CA结构域像Arpin一样抑制Arp2/3复合体，但全长蛋白通过其各结构域（β1, β2, CA）的协同作用，特异性靶向分支连接点，发挥强大的去分支活性，而非抑制成核。研究人员提出了一个工作模型：Coro7可能像“钳子”一样，其β2CA和β1结构域分别结合在女儿丝的两侧，β2CA的α螺旋插入Arp3的疏水裂隙，竞争性取代女儿丝末端肌动蛋白亚基的D-loop，而β1可能同时作用于Arp2界面，共同破坏Arp2/3复合体与女儿丝之间的连接，从而实现分支解离（类似Gelsolin切断肌动蛋白丝的机制）。一旦连接断开，Arp2/3复合体与母亲丝的亲和力很低，会迅速解离并恢复无活性状态。这项研究不仅揭示了Coronin家族一个新成员的特殊工作机制，而且将Arp2/3复合体的分支动力学与细胞内ER-Golgi运输途径的具体生理过程紧密联系起来，为理解肌动蛋白细胞骨架在膜泡运输中的精确调控提供了新的分子见解。