PRKG1调控横纹肌肉瘤肌源性分化阻滞并预测AKT抑制剂ipatasertib疗效

《Nature Communications》：PRKG1 hinders myogenic differentiation and predicts response to AKT inhibitor ipatasertib in Rhabdomyosarcoma

本研究针对横纹肌肉瘤(RMS)中普遍存在的AKT/mTOR通路激活但靶向治疗效果有限的问题，揭示了cGMP依赖性蛋白激酶PRKG1在维持RMS肌源性分化阻滞中的关键作用。研究发现ATP竞争性AKT抑制剂ipatasertib通过同时抑制AKT和PRKG1，诱导RMS细胞分化并抑制肿瘤生长，且PRKG1表达水平可作为ipatasertib疗效的预测生物标志物。该研究为RMS的靶向治疗提供了新的策略和临床转化依据。

　　

在儿童软组织肉瘤中，横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma， RMS）是最常见的类型，它是一种发育性肿瘤，其特征是骨骼肌前体细胞的肌源性分化过程被阻断。尽管RMS细胞表达MYOD1和MYOG等肌源性调节因子，但它们无法完成终末分化。这种分化阻滞是RMS发生发展的核心环节。近年来，研究人员试图通过诱导RMS细胞分化来治疗这种恶性肿瘤，但临床转化面临挑战。

RMS传统上分为腺泡型（ARMS）和胚胎型（ERMS），其中PAX3/7-FOXO1融合基因的存在定义了融合阳性（FP）亚型，而缺乏该融合则为融合阴性（FN）。FP-RMS通常预后较差。尽管AKT/mTOR信号通路在RMS中普遍激活，并且与患者不良预后相关，但AKT抑制剂的临床应用效果有限。这种有限的效果提示我们，RMS对AKT抑制剂的反应可能存在异质性，但其背后的机制尚不清楚。

本研究始于一个临床病例：一名4个月大的FN-RMS女婴在首次复发后，研究人员将其肿瘤样本建立为肿瘤球模型（HSJD-E001_s）。临床前实验发现，该模型对ATP竞争性AKT抑制剂ipatasertib敏感，但对变构抑制剂miransertib不敏感。然而，当该患者第二次中枢神经系统复发后，即使使用ipatasertib进行同情用药，病情仍迅速进展并死亡。这一临床与临床前结果的矛盾促使研究团队深入探索ipatasertib在RMS中发挥作用的精确机制以及预测其疗效的生物标志物。

为了捕捉RMS患者的异质性，研究人员建立了一系列患者来源的异种移植（PDX）模型及其衍生细胞系，包括FP和FN亚型。通过体内外实验，他们证实了ipatasertib相较于miransertib在部分RMS模型中具有显著更强的抗肿瘤活性。值得注意的是，两种抑制剂都能有效抑制AKT/mTOR通路（表现为pS6水平下降），但只有ipatasertib能诱导肌源性分化相关基因的上调。这一现象提示，ipatasertib的抗肿瘤效应可能不完全依赖于AKT抑制。

通过激组学分析和计算机模拟，研究人员将目光投向了一个新的靶点：PRKG1（cGMP-dependent protein kinase）。PRKG1与AKT同属于AGC激酶家族，共享相似的ATP结合口袋。分子对接和分子动力学模拟表明，ipatasertib能够以高亲和力同时结合AKT和PRKG1，而miransertib由于其变构抑制机制，不能抑制PRKG1。功能实验证实，敲低或敲除PRKG1能显著抑制RMS细胞在体外的增殖以及在小鼠体内的成瘤能力。更重要的是，PRKG1的缺失诱导了RMS细胞的肌源性分化，表现为终末肌源性标志物（如TNNI1， MYH8）的表达上调，而间充质干细胞相关基因表达下调。机制上，ChIP-seq和ChIP-qPCR数据显示，肌源性主调控因子MYOD1结合在PRKG1基因的启动子区域，表明PRKG1是MYOD1调控的肌源性分化程序的一部分。

对公共数据库和本研究中心样本的分析显示，PRKG1在胎儿骨骼肌前体细胞中高表达，并且在RMS中的表达水平显著高于其他发育性癌症，且与融合状态无关。单细胞RNA测序数据分析进一步揭示，PRKG1高表达于RMS肿瘤细胞的间充质和早期成肌细胞簇，提示其与未分化的、具有干细胞特性的细胞状态相关。

最关键的是，PRKG1的表达水平与ipatasertib的疗效密切相关。在多个RMS PDX模型中，PRKG1高表达的肿瘤对ipatasertib治疗表现出完全或部分缓解，而PRKG1低表达的肿瘤则疗效不佳。药代动力学研究显示，临床相关剂量（25 mg/kg和100 mg/kg）的ipatasertib均能在肿瘤组织中达到有效浓度（>1μM）并持续抑制AKT通路活性。即使肿瘤在停药后复发，再次使用ipatasertib仍然有效。

本研究主要运用了以下关键技术方法：利用患者来源异种移植（PDX）模型进行体内药效评价；通过shRNA和CRISPR-Cas9技术进行基因敲低和敲除；采用RNA测序（RNA-seq）和基因芯片进行转录组分析；借助分子对接和分子动力学模拟研究药物与靶点的相互作用；通过免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹（Western blot）进行蛋白表达和磷酸化水平检测；并开展了详细的药代动力学（PK）和药效学（PD）分析。

PRKG1 hinders myogenic differentiation and predicts response to AKT inhibitor ipatasertib in Rhabdomyosarcoma

研究结果

PRKG1是RMS生长所必需的

在体内实验中，通过shRNA或CRISPR-Cas9技术敲低或敲除PRKG1，能显著延迟RH4（FP-RMS）和RD（FN-RMS）细胞在小鼠体内形成的肿瘤的生长。Western blot和IHC分析证实了PRKG1在肿瘤组织中的成功敲低，并且PRKG1缺失的肿瘤表现出Ki67阳性细胞减少，表明增殖受到抑制。

沉默PRKG1诱导RMS肌源性分化

对PRKG1敲除的RH4细胞进行RNA-seq分析，发现1460个基因上调，568个基因下调。基因集富集分析（GSEA）显示"肌生成"（myogenesis）标志性通路显著富集。上调的基因包括终末分化肌源性基因（TNNI1， MYL1， MYH8， TTN），而下调的基因则与间充质干细胞表型相关（COL3A1， MEST， BMPR1A）。RT-qPCR和免疫荧光染色在mRNA和蛋白水平验证了这些分化标志物的上调。此外，研究还发现MYOD1结合在PRKG1的转录起始位点，并且沉默MYOD1会导致PRKG1表达上调，同时终末肌源性标志物表达下降，揭示了PRKG1受MYOD1调控并参与肌源性分化阻滞的反馈环路。

PRKG1在胎儿组织中表达并与RMS中间充质细胞状态相关

生物信息学分析显示，PRKG1在人类骨骼肌前体细胞中高表达。在多种发育性癌症中，RMS的PRKG1表达水平最高，且与融合状态无关。对RMS样本的转录组分析表明，PRKG1高表达的肿瘤富集了间充质发育相关基因和mTORC1通路基因。利用公共单细胞RNA-seq数据（Patel et al.， 2022）进行的分析显示，PRKG1在间充质和早期成肌细胞簇中表达最高，并且其表达与间充质基因特征显著相关，进一步支持了PRKG1在维持RMS未分化状态中的作用。

PRKG1水平预测ipatasertib在RMS中的抗肿瘤活性

在6个不同的RMS PDX模型（包括FP和FN）中评估ipatasertib的疗效。根据肿瘤体积缩小程度，可将模型分为应答组（如ERMS-011， ARMS-010， ARMS-006）和无应答/弱应答组（如ERMS-024， ARMS-007， ARMS-001）。PRKG1的mRNA水平与ipatasertib的疗效呈正相关，应答组肿瘤的PRKG1表达显著高于无应答组。药代动力学研究证实，在应答和非应答模型中，ipatasertib均能达到有效的瘤内浓度并抑制pS6，表明疗效差异源于肿瘤细胞的内在生物学特性，而非药物分布问题。值得注意的是，在本文的索引病例中，第二次复发样本（ERMS-024）的PRKG1蛋白水平低于第一次复发样本（E001），这与其对ipatasertib的耐药性相符。

研究结论与意义

本研究首次揭示了PRKG1在横纹肌肉瘤肌源性分化阻滞中的核心作用。研究发现，ATP竞争性AKT抑制剂ipatasertib能够通过同时抑制AKT和PRKG1，解除RMS的分化阻滞，诱导肿瘤细胞向终末肌源性分化，从而发挥抗肿瘤效应。而变构AKT抑制剂miransertib由于不抑制PRKG1，因此不具备此分化诱导能力。

更重要的是，本研究确立了PRKG1作为预测ipatasertib疗效的生物标志物。PRKG1高表达的RMS肿瘤对ipatasertib治疗更敏感。这一发现为在临床中精准筛选可能从ipatasertib治疗中获益的RMS患者提供了依据。

在转化医学方面，研究证实了临床可行剂量（25 mg/kg和100 mg/kg）的ipatasertib能在RMS肿瘤中达到有效的药物浓度并持续抑制靶点。虽然单药治疗停药后肿瘤会再生，但再次给药仍然有效，提示维持治疗策略可能延长患者缓解期。

该研究不仅深化了对RMS病理机制的理解，揭示了分化阻滞的一个关键环节，而且为这种难治性儿童肿瘤提供了新的治疗策略和伴随诊断工具。PRKG1作为疗效预测标志物，有望在未来针对RMS的ipatasertib临床试验中用于患者分层，实现个体化治疗，改善高危RMS患者的预后。论文发表于《Nature Communications》，其发现为靶向肿瘤细胞分化状态的癌症治疗理念提供了强有力的证据。