Carafe：基于DIA数据深度学习优化的原位谱库生成新方法，提升数据非依赖采集蛋白质组学分析效能

《Nature Communications》：Carafe enables high quality in silico spectral library generation for data-independent acquisition proteomics

本研究针对数据非依赖采集（DIA）蛋白质组学分析中，传统谱库因依赖数据依赖采集（DDA）数据而存在碎片离子强度和保留时间（RT）预测偏差的问题，开发了Carafe工具。该工具通过直接训练深度学习模型于DIA数据，结合双路径干扰峰掩蔽策略，显著提升了碎片离子强度和RT预测精度。实验表明，Carafe生成的谱库在多种仪器平台（如TripleTOF 5600、Orbitrap Astral）上均能提高肽段检测数量（最高提升38.0%），且通过Skyline集成实现了用户友好化。该研究为DIA数据分析提供了更精准、高效的谱库构建方案，推动了蛋白质组学的标准化应用。

　　

论文解读

在蛋白质组学研究中，数据非依赖采集（Data-Independent Acquisition, DIA）技术因其高重复性和系统性采样能力，逐渐成为定量分析的重要策略。然而，DIA数据分析高度依赖高质量的谱库，而现有谱库多基于数据依赖采集（Data-Dependent Acquisition, DIA）数据生成或通过DDA训练的模型预测，导致碎片离子强度和保留时间（Retention Time, RT）存在系统性偏差。这种偏差主要源于DDA与DIA在碰撞能量优化、液相色谱（Liquid Chromatography, LC）条件等方面的差异，限制了DIA数据的分析精度和覆盖范围。

为解决这一问题，美国华盛顿大学基因组科学系的Bo Wen等研究者在《Nature Communications》上发表了题为“Carafe enables high quality in silico spectral library generation for data-independent acquisition proteomics”的研究。他们开发了Carafe工具，通过直接利用DIA数据训练深度学习模型，生成实验特异性的高质量计算机谱库，显著提升了肽段检测能力和定量准确性。

关键技术方法

研究团队基于AlphaPeptDeep框架，开发了支持峰值掩蔽的Transformer模型预测碎片离子强度，以及混合卷积神经网络（CNN）和双向长短期记忆网络（BiLSTM）预测RT。训练数据来自单次DIA运行（如人细胞系样本），通过DIA-NN或Skyline检测肽段，并采用双路径策略（谱中心法和肽中心法）识别干扰峰，在训练中掩蔽共享峰以提升模型鲁棒性。生成的谱库支持多物种（如人、酵母、宏蛋白质组），并通过Skyline集成简化了使用流程。

研究结果

1. Carafe提升碎片离子强度与RT预测精度

通过对比四种DIA数据集（包括全球蛋白质组、磷酸化蛋白质组和宏蛋白质组数据），Carafe微调后的模型在碎片离子强度预测的斯皮尔曼相关系数中位数提升0.05，且79.60%的肽段相关性改善。RT预测模型在线性相关性（R² > 0.98）和梯度一致性方面均优于DDA预训练模型，尤其在晚洗脱肽段中表现显著。

2. 干扰峰掩蔽策略优化模型训练

双路径掩蔽方法（谱中心法检测多肽共享峰，肽中心法通过碎片离子色谱图相关性识别干扰）可覆盖48.4%的共享峰，其中肽中心法贡献94.9%。掩蔽后，非干扰峰的预测相关性提升至0.82，而双方法均标记的干扰峰相关性仅0.32。

3. Carafe谱库显著增强肽段检测能力

在DIA-NN分析中，Carafe全微调谱库（MS2/RT）相比DDA预训练模型和DIA-NN内置模型，肽段前体检测数量分别提升5.1-38.0%和2.6-27.1%。部分微调（仅MS2或仅RT）亦优于DDA模型，但全微调效果最优。

4. 错误发现率（FDR）与定位准确性验证

通过诱饵数据库策略评估，Carafe谱库在1% FDR阈值下的错误发现比例（1.00-1.09%）与DDA模型相当，且磷酸化肽段位点错误定位率为0%，表明无数据泄漏或过拟合风险。

5. 优于GPF DIA衍生的色谱图库

与EncyclopeDIA生成的GPF（气相分级）DIA色谱图库相比，Carafe谱库在肽段检测数量上提升3.2-18.5%，且Carafe缩减版谱库（仅含GPF检测肽段）仍优于Prosit+GPF库，证明其预测质量更高。

6. 定量分析精度与生物学应用验证

在LFQbench数据集中，Carafe谱库的定量变异系数（CV）中位数更低，且比例估计（如人1:1、酵母10:1）准确；在EGF刺激的HeLa磷酸化数据集分析中，Carafe额外识别出20%的差异表达磷酸肽，包括7个EGFR磷酸化位点（DIA-NN仅识别4个），且结果与生物学预期一致。

结论与意义

Carafe通过直接利用DIA数据微调深度学习模型，解决了传统谱库因DDA与DIA数据差异导致的预测偏差问题。其双路径干扰峰掩蔽策略有效提升了模型在复杂DIA光谱中的鲁棒性，而Skyline集成降低了使用门槛。该工具在多种仪器平台和样本类型（如磷酸化蛋白质组）中均表现出优越的检测能力和定量准确性，为DIA蛋白质组学的标准化和推广应用提供了关键技术支持。未来，Carafe有望扩展至更多仪器平台（如timsTOF），进一步推动蛋白质组学研究的深度与广度。