点击交联：基于点击化学的细胞兼容性蛋白质交联新策略

《Nature Communications》：Click-linking: a cell-compatible protein crosslinking method based on click chemistry

本研究针对原位交联质谱（XL-MS）技术交联效率低、采样深度不足的问题，开发了一种名为“点击交联”的新方法。研究人员通过甲醛预固定稳定空间蛋白质组，利用NHS修饰的点击化学前体分步标记可及性赖氨酸，再通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）高效生成蛋白质交联。该方法交联产率接近30%，检测到的蛋白质相互作用（PPIs）数量较传统DSS方法提高约20倍，且不引起明显细胞超结构变形，为深度解析相互作用组提供了强大工具。

　　

在生命科学的微观世界里，蛋白质如同精密机器中的齿轮，通过复杂的相互作用网络驱动着细胞的各项功能。然而，绘制这幅蛋白质相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）的“社交网络图”却一直是个巨大挑战。传统方法如亲和纯化质谱（AP-MS）和邻近标记技术只能间接推断相互作用，而具有直接探测能力的交联质谱（Crosslinking Mass Spectrometry, XL-MS）技术又面临着一个棘手难题——交联反应效率极低，难以深度采样复杂的相互作用组。

目前原位XL-MS技术的采样深度仍然低得令人沮丧。当科学家试图用传统的双功能试剂（如DSS）处理活细胞时，试剂在细胞内的渗透性差、反应条件漫长（长达1小时），这些都不利于维持细胞结构的完整性。更糟糕的是，传统交联试剂容易部分水解，与生物分子发生副反应，甚至自我竞争，导致单链接成为主要产物，交联产率极低。这些问题严重限制了XL-MS技术在精准绘制蛋白质相互作用图谱方面的应用潜力。

针对这些挑战，加拿大卡尔加大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项创新性研究，提出了一种名为“点击交联”（click-linking）的全新策略。这种方法巧妙地将交联反应分解为两个连续且正交的耦合事件，大幅提高了交联效率，为深度解析蛋白质相互作用网络提供了强大工具。

研究人员开展的核心创新在于重新设计了交联反应的化学过程。他们不再使用单一分子同时完成两个反应，而是将过程分为两步：首先用甲醛预固定细胞稳定空间蛋白质组，然后同时引入两种NHS修饰的点击化学前体（试剂1和试剂2）标记表面可及的赖氨酸残基；洗去未反应的试剂后，再通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）在安装的前体之间生成交联。

主要关键技术方法包括：细胞甲醛固定与透化处理、NHS酯生物共轭标记、铜催化叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）、应变促进的炔烃-叠氮环加成反应（SPAAC）封端、荧光成像验证、交联质谱（XL-MS）分析、尺寸排阻色谱（SEC）与高pH反相色谱分级、以及多种生物信息学工具（pLink2、CRIMP 2.0、MS Annika 3.0）进行交联肽段鉴定。实验使用A549人肺腺癌细胞系。

结果

解构交联反应

研究团队选择正交的耦合化学：第一步使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯选择性生物共轭赖氨酸中的游离胺和蛋白质N末端；第二步采用铜（I）催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）。这两种前体同时以1：1摩尔比安装时，每个游离胺将拥有等量的每种点击前体，交联产率最高可达组合插入水平的50%。当附近可交联赖氨酸数量增加时，交联产率可接近100%。

反应-第一步

研究人员使用常规FIX-MS方法固定和透化人A549细胞，然后以等摩尔量加入2，5-二氧代吡咯烷-1-基3-（丙-2-炔氧基）丙酸酯（试剂1）和（2，5-二氧代吡咯烷-1-基）6-叠氮己酸酯（试剂2）。总浓度2mM反应60分钟产生了高标记水平，36%的总信号来自标记肽段。约90%安装的标记位于表面暴露的赖氨酸上。标记深度广泛反映了蛋白质组的组成，似乎跨越了蛋白质表达的整个范围进行了采样。

反应-第二步

团队探索了催化剂组成和反应时间对实现高效点击反应的影响。使用新一代配体BTTES（3-（4-（（双（（1-（叔丁基）-1H-1，2，3-三唑-4-基）甲基）氨基）甲基）-1H-1，2，3-三唑-1-基）丙烷-1-磺酸），标准CuAAC反应条件高度有效，15分钟内几乎定量转化炔丙基为三唑。在牛血清白蛋白（BSA）上测试时，检测到582个交联（519个链内交联和63个环状交联），优于标准DSS交联反应（362个交联）。

点击交联-安装前体的原位点击反应

使用减法定量方法评估性能，监测可检测点击前体水平的下降。在1x标记实验中，炔烃修饰肽段下降80%，叠氮修饰肽段下降89%。代代谢组学分析显示，点击交联工作流程将胺反应性代谢物池减少到几乎检测不到的水平。前体的减少似乎完全是由于产生蛋白质内和蛋白质间交联所致，表明1x反应的交联产率约为30%，显著高于传统交联方法0.1%的估计。

荧光成像策略进一步验证了这一估计。分别用试剂1和试剂2处理A549细胞培养物，然后分别与叠氮-Cy5和DBCO-Cy3点击，标记广泛分布在整个细胞中。在预点击样品中观察到强烈的全细胞标记，点击后荧光强度降至初始的30.4%，与MS定量交联产率基本一致。

点击交联不扭曲细胞超结构

研究发现细胞在点击交联过程中保持固定和稳定，相对于未标记对照，可逆的赖氨酸-甲醛交联似乎不显著促进点击交联中使用的固定过程。微管结构在点击交联后没有明显变化，甚至中期有丝分裂纺锤体的脆弱机制也得以保留，支持空间蛋白质组在点击交联过程中保持稳定的观察。

点击交联优于标准交联和FIX-MS

处理1x点击交联的A549细胞进行XL-MS实验，与两种知名NHS基交联试剂DSS和PhoX比较性能。点击交联产生的交联谱图匹配数（CSMs）和独特交联肽数量略高于FIX-MS安装的DSS，但反应产物分布截然不同。点击联产生更大比例的结构信息性交联，整整60%的交联是有用的距离测量（链间和链内交联），而DSS为35%，PhoX为25%。尽管点击交联产生的交联比PhoX少60%，但检测到的PPIs数量更多。

深度分析原位点击交联反应

由于这些点击交联前体尚不可富集，线性游离肽段仍构成典型实验中最大的部分（86%）。添加额外的尺寸排阻色谱（SEC）分级步骤后，鉴定出1700个PPIs，是PhoX的五倍，且有利的反应产物分布得以保留。评估这些PPIs与STRING数据库对比，注意到虽然很大一部分得到高STRING分数证实，但更大部分未在数据库中找到。基因本体（Gene Ontology, GO）分析表明，94%的STRING分数大于零的命中中的PPIs由来自相同细胞区室的蛋白质组成，而随机抽样仅有21%的可能性。未找到类别中49%的PPIs具有共享区室，表明28%可能是正确的。

研究结论与意义

点击交联是一种非常有效的提高蛋白质交联产率的方案，避免了传统方法的弱点。该方法首先促进了对化学反应本身更大的控制。预稳定蛋白质组允许洗去部分水解的点击前体以及标记的代谢物，这两类都是主要的竞争反应产物。此外，避免了自我竞争——即如果两个可连接残基各自被不同的前体标记，它们不能相互交联。在点击交联中，竞争只能发生在第二步反应中，但这将始终产生蛋白质交联。

尽管产率明显优于其他方法，但考虑到产率显著增加，PPI检测数量没有高于呈现的数字有些令人惊讶。原因复杂，但值得注意的是搜索引擎尚未针对这种规模的搜索进行优化。然而，将细胞固定与多步反应相结合，相对于经典交联方法提供了明显优势，并说明了一种可扩展到许多其他试剂组合以追求深度相互作用组采样的通用策略。

这项研究开发的点击交联方法不仅显著提高了交联效率，而且保持了细胞超结构的完整性，为在近生理条件下深度绘制蛋白质相互作用图谱提供了强大工具。随着搜索算法的进一步优化和富集策略的开发，点击交联有望成为揭示细胞内蛋白质相互作用网络的有力武器，推动结构系统生物学的发展。