细胞内镁离子锁定人源TRPV6通道关闭状态的分子机制解析

《Nature Communications》：The locking mechanism of human TRPV6 inhibition by intracellular magnesium

本研究针对TRPV6通道过度激活与癌症等疾病进展相关的临床问题，通过冷冻电镜、突变分析、电生理记录和分子动力学模拟等多技术融合，揭示了细胞内Mg2+通过结合S5螺旋的D489和S6螺旋的D580形成特异性结合位点，阻止S6发生α-to-π螺旋转变，从而将通道锁定在关闭状态的新机制。这一发现为开发TRPV6相关疾病的治疗策略提供了关键理论基础。

　　

在人体细胞中，钙离子的精确调控对维持生命活动至关重要。TRPV6作为钙离子进入细胞的主要通道，其活性异常与多种重大疾病密切相关，尤其在某些最具侵袭性的癌症中过度表达，包括白血病、乳腺癌、前列腺癌等，因此被认定为"癌通道"。然而，这个持续活跃的通道如何被精确调控，特别是在生理条件下如何被细胞内镁离子抑制的分子机制，长期以来一直是个未解之谜。

传统观点认为镁离子可能通过阻塞通道孔来抑制TRPV6功能，但这种推测缺乏直接的结构证据。同时，TRPV6还受到钙离子和钙调蛋白的复杂调控，镁离子在这个精密调控网络中扮演的确切角色亟待阐明。解决这一科学问题，不仅有助于理解TRPV6的基础生物学功能，更为开发针对TRPV6相关疾病的治疗方法提供关键见解。

为了揭示这一机制，研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，综合运用单颗粒冷冻电镜技术、电生理学分析和分子动力学模拟等方法，系统阐述了细胞内镁离子抑制TRPV6的精确分子途径。

研究采用的主要技术方法包括：利用冷冻电镜解析TRPV6与Mg²⁺复合物的高分辨率结构；通过全细胞和膜片钳电生理技术分析TRPV6功能；采用点突变技术验证关键氨基酸残基功能；运用分子动力学模拟计算Mg²⁺结合自由能；使用HEK293细胞系进行通道表达和功能研究。

Mg²⁺对hTRPV6的功能抑制作用

研究人员首先通过电生理实验证实了细胞内Mg²⁺对TRPV6通道的抑制作用。在应用电压斜坡协议时，2mM细胞内Mg²⁺显著降低了负膜电位下的内向电流，并完全阻断了正膜电位下的外向电流。通过电压阶跃协议进一步分析抑制动力学发现，Mg²⁺的存在显著延迟了内向电流的发展，而外向电流则完全被抑制，表明Mg²⁺在正膜电位下产生持续阻断作用，而在负膜电位下这种阻断可被部分缓解。

hTRPV6与Mg²⁺复合物的结构解析

研究团队成功解析了在Mg²⁺存在下hTRPV6的冷冻电镜结构，分辨率达到2.97?。该结构显示，每个TRPV6亚基的S5螺旋和S6螺旋之间形成了一个独特的Mg²⁺结合位点。这一位点由D489（位于S5螺旋）和D580（位于S6螺旋）的羧基共同协调Mg²⁺离子，同时K484的骨架羰基也参与配位。

hTRPV6_Mg结构代表关闭状态

与开放的TRPV6结构相比，hTRPV6_Mg结构的孔道区域存在两个狭窄收缩：一个位于选择性过滤器（由D542形成），另一个位于门控区域（由L574和M578形成）。更重要的是，在开放状态下存在的S6螺旋π凸起在结合Mg²⁺后完全转变为α螺旋，这种构象变化导致孔道变窄，将通道锁定在关闭状态。

推定的Mg²⁺结合位点的功能效应

为验证推定的Mg²⁺结合位点的功能重要性，研究人员构建了D489和D580的点突变体。功能分析显示，D580R突变显著减弱了TRPV6对生理浓度Mg²⁺（0.5和2mM）的敏感性，而D580E突变则保留了通道功能，表明带负电荷的D580侧链对Mg²⁺效应至关重要。这些结果证实D480确实参与介导了细胞内Mg²⁺对hTRPV6通道的调控。

Mg²⁺与D489-D580位点结合的自由能计算

通过分子动力学模拟计算结合自由能发现，Mg²⁺与D489-D580位点的标准结合自由能（ΔG°）为-12.9±0.4kJ/mol，而Ca²⁺仅为-3.7±0.6kJ/mol，表明该位点对Mg²⁺具有高度选择性（选择性比Ca²⁺强约35倍）。这种选择性源于Mg²⁺优化几何构型中D489和D580氧原子的近乎完美的八面体配位环境。

TRPV6被Mg²⁺抑制的机制

研究最终提出了一个全新的工作机制模型：在TRPV6关闭状态下，D489和D580空间位置接近，可共同协调一个Mg²⁺离子。Mg²⁺结合后，阻止了D489与T581之间氢键的形成，而这种相互作用在开放状态下能稳定S6螺旋的π凸起。因此，Mg²⁺通过"劫持"D489，使其无法参与稳定开放状态，从而将通道锁定在关闭构象。

这项研究首次在原子水平揭示了细胞内Mg²⁺通过特异性结合位点调控TRPV6通道的新机制，突破了传统认为Mg²⁺仅通过孔道阻塞发挥抑制作用的认知。发现D489-D580这一新型调控位点不仅深化了对TRP通道家族调控机制的理解，也为针对TRPV6过度活化相关疾病（尤其是癌症）的药物研发提供了新靶点。该机制可能代表了一种进化上保守的离子通道调控模式，为研究其他TRP通道的Mg²⁺调控机制提供了重要参考。