模块化蛋白质支架架构与AI引导序列优化促进从头设计金属酶工程

《Structure》：Modular protein scaffold architecture and AI-guided sequence optimization facilitate de novo metalloenzyme engineering

本研究针对从头设计金属酶催化效率低、构象动态调控难的问题，通过整合X射线晶体学、NMR波谱学、分子动力学模拟与AI辅助的ProteinMPNN序列重设计，系统解析了TFD支架的构象动态与金属结合特性。研究发现柔性结构域连接子介导的构象平衡是功能优化的关键，并通过AI序列优化成功稳定活性构象，将光酶催化效率提升10倍。该工作为动态调控的从头酶设计提供了新范式，发表于《Structure》。

　　

在合成生物学和生物催化领域，创造具有非天然催化功能的高效酶一直是科学家追求的目标。金属酶因其金属辅因子赋予的多样化反应活性而备受关注，但如何通过计算设计获得兼具稳定结构和动态催化功能的金属酶仍面临巨大挑战。传统的蛋白质设计方法往往产生刚性过强的支架，缺乏天然酶中至关重要的构象柔性，导致催化效率受限。

为了突破这一瓶颈，德国慕尼黑工业大学的Paula Wagner Egea、Florent Delhommel等研究人员在《Structure》杂志上发表了一项创新性研究。他们以自主开发的TFD（TIM-ferredoxin）支架为模型，探索了模块化蛋白质架构在金属酶设计中的潜力，并首次将AI驱动的序列优化策略应用于调控从头设计蛋白的构象平衡。

TFD支架采用独特的双结构域设计：一个分裂的TIM桶状结构域负责金属结合，一个铁氧还蛋白（ferredoxin）结构域作为活性位点盖子，两者通过三甘氨酸连接子相连。这种设计理论上允许结构域间运动，但如何精确调控这种动态性以实现最优催化功能尚不明确。

研究人员首先通过理性设计改变TFD的金属特异性，将原本特异性结合镧系离子的TFD-EE（E31/E154）突变为TFD-EH（E31/H154），成功将其改造为可结合Cu^II、Ni^II等过渡金属离子的变体。晶体结构显示，单点突变不仅改变了金属配位几何，还引起了支架整体构象的显著变化。

通过整合NMR波谱学和分子动力学模拟，团队发现TFD支架确实存在显著的构象动态性。三甘氨酸连接子和C端螺旋表现出高度柔性，而金属结合能够调控局部和全局的蛋白质动态。特别重要的是，他们发现原始TFD-EE变体在金属游离状态下存在不利的构象平衡，导致金属结合缓慢且不完全，这直接限制了其光酶催化活性。

针对这一瓶颈，研究人员创新性地应用了深度学习工具ProteinMPNN进行序列重设计。在保持关键功能位点（W6天线残基、金属配位谷氨酸、三甘氨酸连接子）不变的前提下，对TFD-EE支架进行全局序列优化。获得的TFD-EE MPNN变体具有48.8%的序列同一性，不仅保持了正确的折叠和金属结合能力，更重要的是彻底解决了不利构象平衡的问题。

实验验证表明，重设计变体在室温下即可获得良好的NMR谱图，金属结合动力学显著加快，SEC-SLS显示仅存在单一的二聚体物种。结构分析揭示，MPNN redesign在二聚体界面引入了额外的稳定相互作用，包括疏水堆积和盐桥网络，有效补偿了金属结合位点四个谷氨酸带来的电荷排斥。

功能上，TFD-EE MPNN在铈（Ce）依赖的光催化模型反应——氢化苯偶姻（hydrobenzoin）的C-C键裂解中表现出色。与原始支架相比，其催化效率（k_cat/K_m）提高了10倍，这主要归因于更快的金属结合和优化的构象状态。

本研究的关键技术方法包括：X射线晶体学解析不同金属结合状态下的高分辨率结构；NMR波谱学（化学位移扰动、弛豫测量、伪接触位移）分析蛋白质动态和构象平衡；分子动力学模拟揭示构象变化路径；ProteinMPNN驱动的AI序列优化；以及光酶活性测定评估催化性能。

点突变调控TFD的金属特异性和整体结构

通过理性设计将TFD-EE的E154突变为组氨酸（TFD-EH），成功将金属结合偏好从镧系离子转向过渡金属。晶体结构显示突变引起支架构象显著变化，并发现意外的双核金属结合位点。

柔性结构域连接子赋予构象动态

NMR弛豫数据和MD模拟一致表明三甘氨酸连接子介导了结构域间运动。主成分分析识别出铰链状运动模式，伪接触位移实验支持构象集合存在。

TFD-EE被困于非理想构象状态

金属游离的TFD-EE存在缓慢交换的构象平衡，需加热预处理才能获得良好NMR信号。SEC-SLS证实存在两种二聚体物种，界面能量计算表明金属结合位点的电荷排斥是主要 destabilizing 因素。

AI引导序列重设计加速金属结合和催化

ProteinMPNN重设计产生的TFD-EE MPNN变体稳定了活性构象，金属结合动力学加快，催化效率提升10倍。界面相互作用分析揭示额外的疏水堆积和盐桥网络是稳定机制的关键。

研究结论与意义

该研究证实模块化蛋白质支架架构是设计动态金属酶的有力平台，首次证明AI引导的序列重设计可有效调控从头蛋白质的构象平衡。通过将理性设计与AI优化相结合，不仅解决了特定支架的功能限制，更为动态调控的酶设计提供了通用策略。这一方法论有望应用于更广泛的蛋白质设计场景，推动创造具有复杂功能的新颖生物催化剂。