将计算模拟与高通量筛选相结合，用于开发高效稳定的超高浓度IgG1抗体制剂

《mAbs》：Integrating computational simulation and high-throughput screening for the development of robust ultra-high concentration formulation of IgG1 antibody

高粘度单克隆抗体（mAb）制剂因注射困难、制造复杂及稳定性问题备受挑战。本研究创新性地整合计算模拟与高通量筛选技术，通过SILCS-Biologics分析预测mAb的结构特性、稳定性及风险点（如补体决定域区域、氧化热点等），结合UNCLE系统的高通量实验验证，成功筛选出10 mM组氨酸缓冲体系、300 mM脯氨酸粘度调节剂及0.5 mg/mL甲硫氨酸抗氧化剂的最佳组合。该制剂在高温（40°C/75%RH）、冻融循环（3次）、振荡（200 rpm）及光照（5000 Lx）等严苛条件下均保持稳定，粘度降至23.78 cP（满足≤25 cP注射要求），且亚可见颗粒检测未发现异常。方法显著缩短开发周期（传统需2个月，现仅需6周），降低70%试剂消耗，为高浓度mAb制剂开发提供可扩展的解决方案。

　　高粘度单克隆抗体（mAb）制剂在注射过程中可能造成障碍，影响制造流程，并可能对药物的稳定性以及患者的治疗效果产生不利影响。然而，这些问题可以通过合理选择合适的辅料以及精细的制剂优化得到有效缓解。本研究提出了一种创新的方法，结合了计算模拟与高通量筛选技术，以提升高浓度mAb制剂开发的效率。具体而言，我们引入了**in silico**建模，基于抗体的结构特征来预测其开发潜力，并揭示了在稳定性和溶解性方面存在中等风险，以及在互补决定区（CDR）中的热点区域。此外，通过预测蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-辅料相互作用，并结合UNCLE这一高通量蛋白质稳定性分析仪，我们成功地筛选出了合适的粘度降低剂、稳定剂和缓冲系统。制剂确认研究的结果表明，最佳制剂在多种条件下表现出卓越的稳定性，包括高温、加速条件、长期储存、光照、光敏感性、震荡以及冻融循环等，从而确保产品的储存和运输安全。这一方法不仅解决了当前高粘度mAb制剂所面临的关键挑战，还为生物制药行业未来的制剂优化工作提供了一个新的框架。

在生物制药领域，蛋白质治疗药物，尤其是单克隆抗体（mAbs），通常需要高浓度的制剂以达到治疗效果。然而，这种高浓度的制剂容易出现自聚集和粘度升高的问题，主要归因于有害的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs），从而影响药物的稳定性、生物利用度和可制造性。为了克服这些问题，辅料常被添加到制剂中，以干扰非特异性PPIs，提高蛋白质的溶解度和稳定性。然而，辅料的选择仍主要依赖于经验性试验和试错方法，缺乏对辅料与蛋白质相互作用的分子机制的深入理解。这种知识的缺失限制了我们预测具有最佳缓冲系统、粘度特征和最小聚集的蛋白质制剂的能力，成为蛋白质药物递送领域的关键瓶颈。

近年来，计算建模作为一种变革性的方法，被广泛应用于解决蛋白质制剂开发中的挑战。**in silico**研究可以预测蛋白质的可药性，作为风险评估和缓解策略的一部分。从机制上看，**in silico**分析利用分子信息学来预测候选分子的各种属性，包括其物理化学特性、结构特征、聚集倾向、可能的翻译后修饰、稳定性曲线和免疫原性。通过利用理论计算结果，**in silico**分析可以高效地对候选药物分子进行排名、筛选和定向优化。为了缓解这些**in silico**预测的风险，可以选择适当的辅料添加到制剂中。此外，在选择同一类辅料时，SILCS（通过配体竞争饱和法进行配体结合位点识别）已被证明在映射蛋白质表面的配体结合热点和易受PPI影响的残基方面具有重要价值。通过大量的分子动力学模拟，SILCS生成功能基团相互作用图（FragMaps），这些图编码了氢键供体/受体、烷基和芳香基团与蛋白质相互作用的能动倾向，同时考虑了脱溶剂化惩罚和构象灵活性。在此基础上，SILCS-Biologics将SILCS框架扩展到蛋白质制剂开发中，通过模拟蛋白质、辅料和溶剂的三维结构和动态变化，形成一个统一的系统，从而实现两项关键分析：（1）SILCS-PPI，利用FragMaps进行抗体-抗体PPI对接，以识别自聚集热点并指导辅料设计，以破坏有害的PPIs；（2）SILCS-Hotspots，通过全局辅料对接预测能够通过有利相互作用（如氢键和疏水堆积）稳定蛋白质的辅料。然而，**in vitro**验证这些预测需要高通量、多参数筛选平台，以将计算预测与生物物理稳定性指标（如热变性、胶体稳定性和聚集倾向）相关联。

实现这种整合的关键在于UNCLE，这是一种高通量蛋白质稳定性分析仪，能够结合动态光散射（DLS）、静态光散射（SLS）、全波长荧光（FLD）和差示扫描荧光（DSF）技术，以评估蛋白质构象稳定性（Tm）、胶体稳定性（Tagg）、分子间相互作用（G22）和多分散性（PDI）等指标，这些评估可以在多种缓冲条件下高效完成。通过利用其超高通量能力（2小时内同时分析48个样本，每项测试使用≤9 μL样品）和微尺度精度，UNCLE使研究人员能够在极短的时间和样品体积内筛选多种辅料-缓冲组合。例如，UNCLE的高通量平台能够快速识别出适合抗体-药物偶联物（ADC）或mAb热稳定性的最佳辅料条件（如聚山梨酯80、甘露醇和甘油），并通过Tm/Tagg测量实现这一目标。同时，它还能优化pH值（如pH 5.0用于单体溶菌酶的稳定性），以防止聚集。这种策略显著提高了药物的稳定性，并提升了实验流程的效率，从而增强了药物的安全性和治疗效果。因此，通过将SILCS-Biologics预测的蛋白质-辅料相互作用与UNCLE获得的实验数据相结合，研究人员现在能够快速识别出最佳的辅料-缓冲组合，以最小化聚集并增强长期稳定性。

本研究提出了一个以计算为导向、高通量筛选验证的策略，该策略揭示了辅料-蛋白质相互作用的原子级机制，并建立了一个预测-实验结合的工作流程（图S1），以加速治疗性蛋白质制剂的开发。这种整合不仅提升了制剂开发的效率，还确保了在不同条件下药物的稳定性。通过结合**in silico**预测和实验验证，我们能够系统地优化缓冲系统、辅料选择和制剂条件，从而满足药物在不同应用场景下的需求。

在本研究中，我们采用了一种系统的方法来优化mAb制剂。首先，通过**in silico**建模，我们评估了药物的开发潜力，识别了潜在的风险点，如稳定性、溶解性和粘度。接着，我们利用SILCS-Biologics分析，预测辅料与蛋白质的相互作用，以指导缓冲系统的筛选。我们通过生成FragMaps和进行PPI模拟，可视化了功能基团的相互作用，识别了高潜力的蛋白质-蛋白质结合位点。此外，我们还分析了辅料的结合位点分布，以确定最适合的辅料组合。最后，我们通过高通量实验平台UNCLE验证了这些预测结果，以确保其在实际应用中的可行性。

为了进一步提高制剂的稳定性，我们还进行了抗氧化剂的筛选。通过**in silico**分析，我们预测了两个可能的氧化位点，分别位于重链（HC63和HC106）的互补决定区（CDR）。为了解决这些位点的氧化风险，我们选择了抗氧化剂，如甲硫氨酸和乙二胺四乙酸（EDTA）加入制剂中。实验结果显示，添加甲硫氨酸显著降低了氧化修饰的比例，而EDTA则导致氧化比例上升。因此，我们选择了甲硫氨酸作为制剂中的抗氧化剂。这一选择不仅有助于提高药物的稳定性，还为制剂设计提供了重要的参考依据。

在粘度降低剂的筛选中，我们发现粘度与浓度之间存在一定的关系，且在高浓度条件下，粘度可能会显著增加。因此，我们通过SILCS-Biologics分析预测了四种可能的粘度降低剂，包括脯氨酸、精氨酸、甘氨酸和赖氨酸。实验结果显示，脯氨酸和精氨酸在粘度降低方面表现出更高的效果，尤其是脯氨酸在300 mM浓度下，将粘度降低至23.78 cP，满足了目标阈值（≤25 cP）和适宜的流变特性，以确保注射过程的顺利进行。此外，脯氨酸相较于精氨酸的优势可能与其在平衡空间位阻和氢键形成方面的能力有关，这种能力能够有效干扰β-折叠结构的形成，而不引起过度的静电排斥效应。

在稳定剂和表面活性剂的筛选过程中，我们评估了不同稳定剂（如蔗糖、甘露醇和山梨醇）与脯氨酸的组合，以确定其对制剂稳定性的贡献。实验结果显示，这些稳定剂在与蛋白质的相互作用方面表现出相似的特性，且其结合位点的分布通过图示方式进行了展示。通过UNCLE系统进行的稳定性测试进一步验证了这些稳定剂的性能，确保了制剂在多种压力条件下的稳定性。最终，我们选择了PS20作为表面活性剂，因为它在震荡条件下表现出较低的乳浊度，同时具备较好的氧化稳定性，能够有效防止蛋白质在动态条件下的聚集。

在制剂确认阶段，我们对多种pH值条件下的制剂进行了稳定性评估，包括pH 4.7、5.0、5.2、5.4和5.7。这些测试涵盖了高温、加速条件、长期储存、光照测试和光敏感性测试等多种环境因素。实验结果显示，这些制剂在不同条件下均表现出良好的稳定性，未出现显著的质量属性变化。特别是在高温和震荡条件下，SEC单体保留率超过95%，SCX主峰变化小于10%，表明制剂对聚集和电荷变异具有良好的抵抗力。此外，这些制剂在制造过程中表现出较高的适应性，能够应对制造过程中的各种变化。

通过本研究，我们不仅成功开发出一种高浓度mAb制剂，还为未来的制剂开发提供了新的思路和方法。这种基于计算建模和高通量实验的策略，能够有效解决高粘度mAb制剂在注射、制造和稳定性方面所面临的挑战。此外，这种策略还可以扩展到其他类型的治疗药物，如IgG4和融合蛋白，从而提高制剂开发的通用性和效率。我们相信，这种整合计算与实验的方法，将在未来的生物制药研发中发挥重要作用，为开发更高效、更安全的生物药物提供坚实的基础。