Cephalanthera erecta (Thunb.) Blume（兰科植物）的完整叶绿体基因组及其系统发育分析

《Mitochondrial DNA Part B》：Complete chloroplast genome of Cephalanthera erecta (Thunb.) Blume (Orchidaceae) and its phylogenetic analysis

该研究完成东亚特有植物天麻（Cephalanthera erecta）的叶绿体基因组测序，揭示其基因组为162,011bp，具有典型四分区结构，包含135个注释基因。系统发育分析显示该物种与C. longibracteata、C. falcata、C. nanchuanica形成强支持的单系群，并支持Cephalanthera与Epipactis的姐妹群关系。基因组资源为东亚兰科植物分类与保护提供基础。

　　本研究旨在揭示一种特有于东亚的陆生兰科植物——直立兜兰（*Cephalanthera erecta*）的叶绿体（chloroplast, cp）基因组结构，以明确其在兰科植物系统发育中的位置。通过这一研究，我们不仅获得了该物种的完整叶绿体基因组数据，还通过与其他相关物种的比较分析，进一步探讨了其在系统发育树中的演化关系。这些发现为未来对兰科植物的系统发育研究、遗传多样性分析以及特有物种的保护策略提供了重要的基因资源。

直立兜兰是一种广泛分布于中国中部和南部、韩国以及日本的陆生兰科植物。该植物在形态上具有独特的特征，例如其叶的数量较少，通常为2至4片，每片叶的长度在2至8厘米之间，与近缘种相比，其叶的数量和长度都存在明显差异。这种形态上的区别提示了其在进化过程中可能经历了不同的适应性变化。然而，尽管直立兜兰在生态和形态上具有重要研究价值，截至目前，尚未有其叶绿体基因组的公开数据。因此，本研究首次完成了直立兜兰的叶绿体基因组测序与组装，并对其基因组成进行了详细注释。

在本研究中，我们获得了162,011个碱基对（bp）的完整叶绿体基因组序列。该基因组具有典型的四分体结构，包括一个大的单拷贝区（LSC，88,944 bp）、一个小的单拷贝区（SSC，19,177 bp）以及一对相同的反向重复区（IRs，各26,945 bp）。这一结构在大多数被子植物的叶绿体基因组中是常见的，但不同物种的结构细节可能会有所不同。通过对这些区域的分析，我们能够识别出135个基因，其中包括88个mRNA基因、38个tRNA基因、8个rRNA基因和一个假基因。这些基因的分布和排列方式对于理解直立兜兰的遗传信息具有重要意义。

在基因组成方面，直立兜兰的叶绿体基因组显示出一定的复杂性。其中，15个基因包含一个内含子，而另外三个基因（*rps*12、*clp*P和*ycf*3）则包含两个内含子。内含子的存在通常表明基因在进化过程中经历了多次结构变化，这可能与物种适应环境或功能分化有关。此外，研究还识别出13个顺式剪接基因和一个反式剪接基因，这为理解叶绿体基因的表达调控机制提供了新的视角。

在系统发育分析方面，我们通过比对22个相关物种的叶绿体基因组序列，构建了最大似然法（maximum-likelihood, ML）的系统发育树。结果表明，直立兜兰与三个近缘种——南川直立兜兰（*C. nanchuanica*）、镰刀直立兜兰（*C. falcata*）和长苞直立兜兰（*C. longibracteata*）形成了一个高度支持的分支，这一结果表明它们共享一个较近的共同祖先。此外，系统发育树还揭示了直立兜兰与Epipactis属植物之间的演化关系，两者形成了相互单系的姐妹群，这一发现为理解兰科植物的系统发育提供了新的分子证据。

在演化意义上，直立兜兰与其他近缘种之间的关系不仅体现在系统发育树的结构上，还可能反映在它们的形态和生态特征上。例如，它们都具有白色或黄色的 spurred 花，但在唇瓣的顶端形态和 spur 的位置上却存在明显差异。这种差异提示了在进化过程中，直立兜兰可能经历了特定的适应性变化，使其在生态和形态上与近缘种有所不同。同时，叶绿体基因组的比较分析也显示，直立兜兰的基因组成与其他近缘种存在显著差异。例如，直立兜兰编码了88个蛋白质编码基因（PCGs）、38个tRNA基因和8个rRNA基因，而其近缘种则只有79个PCGs、30个tRNA基因和4个rRNA基因。这种基因组成的变化可能反映了该物种在进化过程中经历的功能分化和适应性演化。

在数据来源方面，我们使用了GenBank数据库中的多个相关物种的叶绿体基因组序列，包括来自兰科其他属的植物。例如，我们比对了南川直立兜兰、镰刀直立兜兰、长苞直立兜兰、长叶直立兜兰、矮生直立兜兰、红花直立兜兰、Epipactis属的多个物种，如Epipactis thunbergii、Epipactis helleborine、Epipactis mairei，以及Aphyllorchis属和Diplandrorchis属的一些代表。此外，我们还以Erythrodes blumei作为外群，以确保系统发育树的准确性。通过这些比对和分析，我们能够更全面地理解直立兜兰在兰科植物中的系统发育地位。

在实验方法上，我们采用了多种先进的技术和工具。首先，我们使用植物DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech，北京）提取了直立兜兰的基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳对其质量和完整性进行了初步评估。随后，我们利用超声波技术将DNA片段化，并构建了测序文库。这些文库经过质量控制后，使用Illumina Novaseq 6000平台进行了双端测序（PE150），以获得高质量的原始数据。为了提高数据的准确性，我们使用fastp v. 0.23.4对原始数据进行了质量过滤，并通过SPAdes v. 3.10.1进行了基因组组装。最终，我们使用GetOrganelle v.1.7.7.1对叶绿体基因组进行了注释，并通过OGDraw v. 1.2生成了环形基因组图。此外，我们还利用CPGView分析了基因的顺式和反式剪接情况，以进一步揭示其基因表达调控机制。

本研究的成果不仅对直立兜兰的系统发育地位提供了新的证据，还为兰科植物的演化研究提供了重要的基因资源。这些数据将有助于未来对兰科植物遗传多样性的深入研究，以及对特有物种的保护策略制定。此外，由于直立兜兰在东亚地区具有重要的生态和保护价值，其叶绿体基因组数据的公开将为相关领域的科学研究提供基础。

在实验过程中，我们还特别关注了伦理问题。所使用的植物材料均符合国家和国际标准，以及当地法律法规。研究未涉及任何濒危或受保护的物种，因此在采集样本时不需要获得特定的授权。这一做法确保了研究的合法性，并有助于保护该地区的生态环境。

最后，我们提供了补充材料，包括一份详细的补充文档，其中包含了本研究的实验数据、分析方法和相关结论。这些材料将为其他研究者提供参考，帮助他们更好地理解直立兜兰的叶绿体基因组结构和系统发育关系。此外，我们还公开了所有相关的基因组数据，以便其他研究人员能够获取和使用这些信息，推动兰科植物的研究进展。

综上所述，本研究通过对直立兜兰的叶绿体基因组进行测序、组装和注释，揭示了其在系统发育中的位置，并与其他近缘种形成了紧密的演化关系。这些发现不仅丰富了兰科植物的基因资源，还为未来的分类学修订、保护策略制定和适应性演化研究提供了重要的分子基础。同时，研究结果也表明，叶绿体基因组在理解植物演化关系方面具有重要的应用价值。