新的两栖动物骨骼染色方法表明，两种生活在特普伊山顶的无尾目动物（Oreophrynella quelchii，属于蟾蜍科；Pristimantis aureoventris，属于Craugastoridae科）具有不同的寿命

《The European Zoological Journal》：New methodology in amphibian bone staining indicates differential lifespans in two tepui summit anurans (Oreophrynella quelchii, Bufonidae and Pristimantis aureoventris, Craugastoridae)

本研究利用AO染色结合共聚焦显微技术分析委内瑞拉Roraima tepui山顶两种蛙类（Oreophrynella quelchii和Pristimantis aureoventris）的骨生长线，发现O. quelchii寿命较短（平均1年），而P. aureoventris寿命较长（平均3年），揭示两者在相同环境下的不同生存策略。

　　在热带地区，年龄是影响种群动态、生长和繁殖的重要生命历史特征。对于无尾目动物而言，环境条件，尤其是严酷的栖息地，对年龄相关的种群结构具有显著影响。然而，在罗赖马山峰（Roraima-tepui）的山顶，仅有两种两栖动物存在，它们虽然处于相似的恶劣环境条件下，却展现出截然不同的种群特征。其中，蛙类 *Pristimantis aureoventris* 仅在少数标本中被发现，而蟾蜍 *Oreophrynella quelchii* 却在该山顶大量存在，数量惊人。然而，这两种物种的年龄结构仍缺乏深入理解。为了更准确地估计它们的寿命，我们采用了一种新的方法，通过使用乙啶橙染色和共聚焦显微镜来识别骨生长痕迹（GMs），这种方法比传统的骨骼年轮法（skeletochronology）更加敏感且减少主观判断。

罗赖马山峰是位于南美洲东北部圭亚那盾牌区的一组孤立的沙岩桌山，其海拔可达约2800米，山体陡峭，与周围的低地生态隔离。这种特殊的地理和生态环境使得山峰上的生物群落具有高度的特有性，许多物种仅在该区域生存。例如，*O. quelchii* 仅分布于罗赖马山峰和附近的韦-阿西普乌山峰，而 *P. aureoventris* 则仅在少数山峰中被发现，如韦-阿西普乌山峰和库肯安山峰。尽管这些物种在形态学和生态适应性上有所不同，但它们共享相同的极端环境条件，如剧烈的温度波动、强风、强烈的紫外线辐射和季节性降水变化。这些环境因素对两栖动物的生存和繁殖构成挑战，但它们在种群规模和年龄结构上表现出显著差异。

在热带地区的两栖动物中，传统的骨骼年轮法常因环境的持续活跃性和复杂的骨重塑过程而存在不确定性。因此，寻找更可靠的方法成为研究的关键。乙啶橙（Acridine Orange）作为一种荧光染料，能够特异性地结合DNA和糖胺聚糖（GAGs），从而在骨骼切片中提供更清晰的生长痕迹可视化效果。与传统的非荧光染料相比，乙啶橙在共聚焦显微镜下能够提供更高的分辨率和对比度，有助于减少人为误差。此外，通过计算机辅助图像分析技术，我们能够在更系统、客观的基础上识别和计数生长痕迹，从而提高年龄估算的准确性。

本研究的主要目标是通过改进的骨骼年轮技术，评估 *O. quelchii* 和 *P. aureoventris* 在罗赖马山峰的寿命差异。我们从野外采集了这两种物种的股骨样本，并使用乙啶橙染色和共聚焦显微镜对其进行了详细分析。结果显示，*O. quelchii* 的大多数个体仅显示出一个生长痕迹，而 *P. aureoventris* 的所有个体都显示出多个生长痕迹。这一发现表明，*O. quelchii* 的寿命可能较短，而 *P. aureoventris* 的寿命则更长。尽管这两种物种的体长（snout–vent length, SVL）在统计上没有显著差异，但生长痕迹的数量与寿命之间存在一定的关联性。

值得注意的是，生长痕迹的形成可能受到多种因素的影响，包括环境条件、生理状态以及遗传和内分泌机制。在某些热带两栖动物中，生长痕迹的形成并不严格遵循年度周期，这使得传统的年轮法在这些物种中的应用受到限制。因此，本研究采用的乙啶橙染色和共聚焦显微镜技术，为在热带环境中更准确地识别生长痕迹提供了新的思路。此外，计算机辅助的图像分析进一步增强了这一方法的客观性和可重复性，避免了人工计数可能带来的偏差。

在实际操作中，我们发现乙啶橙染色和共聚焦显微镜能够有效区分生长痕迹与细胞核或其他结构，从而提高图像分析的准确性。通过使用多个径向切线（radial transects）和图像处理软件，我们能够更系统地识别生长痕迹，并排除一些可能的干扰因素。这种方法不仅适用于罗赖马山峰的两栖动物，也适用于其他热带和亚热带地区的物种，为研究这些区域的年龄结构和种群动态提供了有力工具。

此外，我们还验证了该方法在其他已知生长痕迹数量的两栖动物中的适用性。例如，在 *Rhinella arenarum*、*Physalaemus cuvieri* 和 *Bufo tibetanus* 等物种中，使用乙啶橙染色和共聚焦显微镜进行图像分析的结果与传统方法一致，说明该方法具有广泛的适用性。这一结果表明，即使在没有明确季节性变化的环境中，通过改进的图像分析技术，我们仍然可以较为准确地估计两栖动物的年龄。

本研究的发现不仅揭示了罗赖马山峰上两种两栖动物的寿命差异，也强调了环境压力和生理适应在塑造年龄结构中的作用。尽管 *O. quelchii* 在野外表现出极高的种群密度，但其寿命较短，可能与高死亡率和快速繁殖策略有关。相比之下，*P. aureoventris* 的寿命更长，这可能与其在极端环境中的适应能力以及更保守的生命周期有关。这些差异提示我们，不同物种在面对相同环境挑战时，可能会采取不同的生存策略，从而形成不同的种群结构。

从生态学角度来看，罗赖马山峰的特殊环境对两栖动物的生存提出了严峻挑战。然而，某些物种如 *O. quelchii* 能够在这种极端条件下大量生存，这可能与其独特的生理适应有关，例如直接发育（direct development）和对环境变化的快速反应能力。而 *P. aureoventris* 的稀有性和隐秘性则可能与其更复杂的生态需求有关，例如对特定植物（如捕虫堇和凤梨科植物）的依赖，这可能使其在资源有限的环境中更难生存。因此，寿命差异可能反映了两种物种在生态适应策略上的不同选择。

研究还表明，生长痕迹的数量与寿命之间存在一定的正相关性，尽管这种关系在不同物种中可能有所不同。例如，在 *O. quelchii* 中，大多数个体仅显示出一个生长痕迹，而 *P. aureoventris* 的个体则显示出多个生长痕迹。这一趋势可能与它们的生命周期和生存策略有关。然而，由于生长痕迹的形成机制尚未完全明确，因此需要更多的研究来验证这一假设。

总的来说，本研究通过引入新的可视化和分析方法，为理解热带两栖动物的年龄结构提供了新的视角。尽管传统的骨骼年轮法在热带物种中存在局限性，但乙啶橙染色和共聚焦显微镜结合计算机图像分析，为更准确地估算年龄提供了一种可行的替代方案。这一方法不仅适用于罗赖马山峰的物种，也为其他热带地区的两栖动物研究提供了技术支持。未来的研究可以进一步探讨生长痕迹形成的机制，以及环境因素如何影响其数量和分布，从而更全面地理解两栖动物在极端环境中的适应策略和种群动态。