《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Clinical emergence of inducible macrolide resistance mediated by acquired erm(41) C28T mutation in Mycobacterium abscessus
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本研究首次报道了在抗微生物治疗压力下，Mycobacterium abscessus的erm(41)基因从C28向T28突变的临床案例，揭示了诱导性耐药在体内发生的新机制。
在这项研究中，我们报告了一例由* erm*(41) T28等位基因介导的可诱导大环内酯类抗生素耐药性病例。*Mycobacterium abscessus*（简称*M. abscessus*）是一种具有高度耐药性的非结核分枝杆菌（NTM），常出现在患有慢性肺部疾病如支气管扩张和囊性纤维化的患者中。由于其对大多数一线抗结核药物和多种其他抗生素具有固有耐药性，管理*M. abscessus*感染构成了重要的治疗挑战。尽管采用了多种联合用药方案，包括阿米卡星、替加环素、头孢西丁和亚胺培南等，但治疗成功率仍然较低，约为30%-50%，并且复发率较高。
*M. abscessus*的耐药性主要通过两种机制表现：一种是通过23S rRNA编码基因*rrl*的突变获得的耐药性，另一种是通过*erm*(41)基因编码的核糖体甲基转移酶介导的固有耐药性。*erm*(41)基因表达水平较低，但在大环内酯类抗生素暴露后会增强表达，从而导致耐药性在治疗1-2周后显现。临床分离的*M. abscessus*菌株在*erm*(41)基因序列上存在差异，尤其是在第28位核苷酸上，导致两种主要基因型：T28和C28。T28型编码具有功能的甲基转移酶，从而赋予可诱导耐药性；而C28型则编码无功能的酶，使得菌株对大环内酯类抗生素敏感，通常与较高的治疗成功率相关。这两种变异被视作自然发生的多态性，因此可诱导耐药性通常被认为是固有特性。
在本研究中，我们描述了一例*M. abscessus*肺部感染病例，其中初始的*erm*(41) C28菌株在长期抗生素治疗过程中，通过自发的C28T点突变获得了可诱导的大环内酯类抗生素耐药性。这一现象提供了首次临床证据，表明在抗生素选择压力下，*erm*(41)介导的可诱导耐药性可以在体内产生。这不仅挑战了传统观点，即可诱导耐药性只能由T28型菌株表达，还提示在某些情况下，即使初始菌株为C28型，也可能在治疗过程中发生基因突变，从而改变其对药物的敏感性。
患者为一名62岁女性，患有支气管扩张和GOLD II期慢性阻塞性肺疾病（COPD）。2021年7月13日，她因发热、咳嗽和胸部CT显示左下叶浸润而入院。痰液的抗酸杆菌涂片为阳性（2+），但Xpert MTB/RIF检测为阴性，提示为NTM肺部感染。她接受了包括利福布汀、乙胺丁醇、阿奇霉素、莫西沙星和阿米卡星在内的经验性治疗。症状有所改善，她于2021年7月20日出院。出院后，她继续接受门诊治疗，包括阿奇霉素、利福布汀、乙胺丁醇和莫西沙星。然而，由于不良反应，她在一个月内停药。2022年2月，她因症状复发和发热（39°C）再次入院。胸部CT显示右下叶有多处密度增加的斑片状阴影。由于2021年7月和9月收集的痰液样本均培养出*M. abscessus*，因此开始靶向治疗，包括阿米卡星（0.4 g静脉每日一次）、头孢西丁（2.0 g静脉每8小时一次）、阿奇霉素（0.5 g口服每日一次）和利奈唑胺（0.6 g口服每日一次），治疗后病情改善，于2022年3月2日出院。出院后，她继续接受肌肉注射阿米卡星（0.4 g静脉每日一次）、阿奇霉素（0.5 g口服每日一次）、利奈唑胺（0.6 g口服每日一次）和利福布汀（0.3 g口服每日一次）。由于患者无法耐受较高剂量的阿米卡星（通常为0.6 g静脉每日一次），因此将阿米卡星剂量降低。阿米卡星在三个月后因耐受性问题停药。2022年4月和7月的随访CT扫描显示影像学上有所改善。患者于2022年7月下旬因支持性治疗短暂住院，随后因影像学改善和药物耐受性问题于2022年7月27日停药。2024年3月随访时，患者仅报告偶尔咳嗽，无其他症状。
在治疗期间，从痰液样本中分离出四种菌株。前三株对大环内酯类抗生素敏感，符合*erm*(41) C28等位基因。而最后一株则表现出可诱导耐药性，对应*erm*(41) T28等位基因。这一结果引发了两种可能的解释：（i）再次感染或混合感染，由T28菌株引起；（ii）在体内发生的C28到T28的突变。为了区分这两种情况，我们对所有四株菌进行了全基因组测序，并将测序数据存入NCBI数据库，访问编号为PRJNA1328661。使用基于组装和基于比对的流程识别基因组变异，参考基因组为GCF_020735345.1。在基于组装的流程中，使用Shovill（v1.0.9）进行基因组组装，Minimap2（v2.26）进行比对，Paftools进行变异识别。在基于比对的流程中，使用Snippy（v4.6.0）进行读取比对和变异检测。我们还纳入了一个包含233种具有全球代表性的*M. abscessus*基因组的参考集，这些基因组是从NCBI数据库中选取的，其两两间的基因组距离大于100个单核苷酸多态性（SNPs）。通过全基因组比对和系统发育分析，我们按照之前的研究方法进行了分析。
根据系统发育分析，参考集中的所有*erm*(41) C28型菌株形成了一个单系的进化枝（C28进化枝），表明它们来源于单一祖先（
17）。本研究中的四株菌株紧密聚类，仅在0-9个SNPs范围内存在差异，表明它们源自同一感染源。在四株菌中，两种流程均一致检测出12个基因组变异（10个SNPs和2个插入缺失；
Table S2），且未发现重组证据。最后一株菌携带*erm*(41) T28等位基因，而前三株携带C28，这证实了在治疗过程中发生C28T突变。最后一株菌的T28等位基因与ATCC 19977中的经典T28等位基因相比存在三个SNPs，但仅与经典C28等位基因相比存在一个SNP，进一步支持了该突变是通过自发突变获得的（
Fig. S1）。
这一发现提供了首次临床证据，表明在抗生素治疗过程中，*erm*(41) C28T突变可以产生获得性可诱导大环内酯类抗生素耐药性。这种耐药性的选择可能与阿米卡星剂量不足有关。由于阿奇霉素和阿米卡星是治疗*M. abscessus*感染最有效的药物，阿米卡星剂量不足可能降低了该药物的选择压力，使阿奇霉素成为主导的选择压力，从而促进了*erm*(41) C28T突变的发生。这一突变在体内的出现表明，可诱导大环内酯类抗生素耐药性可以在药物选择压力下产生。因此，除了筛查导致恒定耐药性的*rrl*突变外，临床医生还应考虑在初始携带C28等位基因的菌株中，*erm*(41)突变导致可诱导耐药性的风险。
*M. abscessus*的治疗一直面临挑战，主要在于其对多种抗生素的耐药性以及治疗方案的复杂性。大环内酯类抗生素，如阿奇霉素和克拉霉素，仍然是治疗的主要支柱，并通常与其他药物如阿米卡星、替加环素、头孢西丁和亚胺培南联合使用。然而，即使采用联合治疗，治疗成功率仍然较低，且患者容易出现复发。这可能与多种因素有关，包括药物剂量、疗程长度、患者的免疫状态以及菌株本身的遗传特性。
在本研究中，患者的治疗过程显示，尽管接受了多种抗生素，但治疗效果并不理想。最初，患者接受了经验性治疗，包括阿奇霉素、利福布汀、乙胺丁醇和莫西沙星。然而，由于不良反应，她在一个月内停药。随后，她接受了靶向治疗，包括阿米卡星、头孢西丁、阿奇霉素和利奈唑胺。治疗过程中，阿米卡星的剂量被调整，以适应患者的耐受性。尽管如此，阿米卡星在三个月后因耐受性问题被停药。治疗期间，患者的影像学检查显示病情有所改善，但随后由于不良反应和病情稳定，治疗被停止。这一治疗过程揭示了抗生素使用过程中，耐药性可能随时间发生变化，特别是在长期治疗和剂量调整的情况下。
值得注意的是，*erm*(41) C28T突变的发生与治疗过程中抗生素的选择压力密切相关。虽然阿奇霉素和阿米卡星是治疗*M. abscessus*感染的首选药物，但阿米卡星的剂量不足可能削弱了其选择作用，使得阿奇霉素成为主要的抗生素选择压力。这种选择压力可能导致菌株在治疗过程中发生突变，从而获得对大环内酯类抗生素的耐药性。这一发现强调了在临床实践中，需要对患者的治疗方案进行动态调整，并密切监测耐药性变化。
此外，这一病例也提醒我们，*erm*(41)基因的变异不仅影响菌株的耐药性，还可能影响其治疗反应。在治疗初期，菌株对大环内酯类抗生素敏感，但在长期治疗后，由于基因突变，其对药物的敏感性发生变化。这种变化可能与治疗过程中抗生素的使用模式有关，例如药物剂量、疗程长度以及药物组合。因此，在制定治疗方案时，需要综合考虑这些因素，以最大程度地减少耐药性发展的可能性。
在临床实践中，对于*M. abscessus*感染的管理需要更加个体化。不同菌株对药物的反应存在差异，这可能与它们的基因型有关。例如，携带T28等位基因的菌株通常表现出可诱导耐药性，而携带C28等位基因的菌株则对大环内酯类抗生素敏感。因此，在治疗过程中，如果患者出现耐药性变化，可能需要重新评估其菌株的基因型，并调整治疗方案。这种调整不仅有助于提高治疗成功率，还可以减少复发的风险。
同时，这一研究还揭示了在治疗过程中，耐药性可能通过自发突变发生。虽然*erm*(41) C28T突变在体外环境中较为罕见，但在体内，特别是在长期抗生素治疗的情况下，这种突变可能发生。这表明，临床医生在面对*M. abscessus*感染时，不能仅依赖于初始的耐药性检测，而应考虑在治疗过程中可能出现的耐药性变化。因此，需要建立更完善的监测体系，以便及时发现耐药性变化并采取相应的措施。
此外，这一病例还强调了抗生素剂量的重要性。阿米卡星作为治疗*M. abscessus*感染的关键药物之一，其剂量不足可能导致选择压力的减弱，从而促进其他药物的选择作用。这种选择作用可能导致菌株发生突变，从而改变其对药物的敏感性。因此，在治疗过程中，需要确保药物剂量的合理性，以最大程度地发挥其抗菌作用，同时减少耐药性发展的可能性。
在实际操作中，抗生素治疗的调整需要基于患者的临床反应和实验室检测结果。例如，如果患者的症状在治疗后没有明显改善，或者出现耐药性变化，可能需要重新评估治疗方案。这种评估可能包括更换抗生素、调整剂量或延长疗程。此外，还需要考虑患者的耐受性，以确保治疗方案的安全性和有效性。
总之，这一研究不仅揭示了*M. abscessus*在治疗过程中可能发生基因突变，从而改变其对药物的敏感性，还强调了在临床实践中，需要对患者的治疗方案进行动态调整，并密切监测耐药性变化。这种监测和调整不仅有助于提高治疗成功率，还可以减少复发的风险，从而改善患者的预后。此外，这一研究还提供了重要的临床证据，表明在体内环境中，*erm*(41)介导的可诱导耐药性可以在抗生素选择压力下产生，这对于未来的临床研究和治疗方案的制定具有重要意义。
