由Sphingobium yanoikuyae DN12菌株对内分泌干扰化合物双酚F的生物降解作用

《Applied and Environmental Microbiology》：Biodegradation of the endocrine-disrupting compound bisphenol F by Sphingobium yanoikuyae DN12

BPF降解机制及新菌种Sphingobium yanoikuyae DN12的发现：通过分离、基因组测序及酶学分析，阐明BPF在bpf基因簇调控下经BpfAB羟基化、BpfC Baeyer-Villiger氧化及BpfD水解的三步降解途径，揭示氧气原子来源及关键酶功能，为污染物治理提供新靶点。

　　### 环境污染物双酚F的微生物降解机制研究

双酚F（BPF）作为一种新型环境污染物，广泛存在于地表水和废水系统中。它在化学工业中被广泛用作双酚A（BPA）的替代品，由于其环境持久性和内分泌干扰特性，对生态系统和人类健康构成了日益增长的威胁。尽管已有研究揭示了BPF的降解途径，但其生物降解的具体机制仍然不明确。为了更深入地理解这一过程，本研究从中国安徽省的一条河流沉积物中分离出了一种高效的BPF降解菌株——*Sphingobium yanoikuyae* DN12。该菌株能够以BPF作为唯一的碳源和能量来源进行生长，这表明其在环境修复中具有重要的应用潜力。

通过超高效液相色谱-高分辨率质谱（UPLC-HRMS）分析，我们发现氧化和水解是BPF生物降解的关键步骤。进一步利用全基因组测序、比较转录组学分析和生化鉴定，我们确定了一个名为*bpf*的基因簇与BPF降解过程相关。其中，BpfAB是一种双组分氧化还原酶，负责将BPF转化为4,4'-二羟基二苯酮（DHBP）；BpfC是一种拜耳-维里格单加氧酶（BVMO），将DHBP转化为4-羟基苯基-4-羟基苯甲酸（HPHB）；BpfD是一种α/β水解酶，将HPHB水解为4-羟基苯甲酸（4HB）和1,4-二羟基苯醌（HQ）。这些发现不仅填补了关于微生物降解BPF分子机制的研究空白，还为预测和评估降解过程中产生的中间产物和最终产物的毒性提供了重要的科学依据，同时为设计高效、安全和可持续的BPF污染治理技术提供了理论指导。

### BPF降解机制的重要性

BPF因其在环境中的广泛存在和潜在危害，成为当前环境科学和微生物学研究的重点对象。作为一种替代BPA的化学品，BPF在食品罐头内衬、涂层、粘合剂和电子产品制造中得到了广泛应用。然而，BPF的暴露已被与多种毒理效应相关联，包括儿童发育风险和水生生物的生殖毒性。尽管已有研究报道了BPF的微生物降解途径，但关键酶的识别及其催化机制仍未完全阐明。本研究通过分离和鉴定* Sphingobium*菌株DN12，明确了其降解BPF的遗传基础，并对三个关键酶——双组分氧化还原酶、单加氧酶和水解酶进行了生化特征分析。这些发现不仅有助于深入理解BPF的降解机制，还为未来开发有效的生物修复策略提供了重要的理论支持。

### 菌株DN12的分离与鉴定

在本研究中，我们采用传统的富集培养技术从河流沉积物中分离出了一种能够高效降解BPF的菌株DN12。该菌株在LB平板上形成光滑、奶油色、椭圆形的菌落，大小为1.7–2.0×0.5–0.7微米，且为革兰氏阴性菌。通过抗生素敏感性测试，我们发现该菌株对链霉素具有抗性。系统发育分析显示，DN12与*Sphingobium*属的物种密切相关，尤其与*S. yanoikuyae* ATCC 51230^T和*S. scionense* WP01^T形成紧密的聚类，序列一致性达到100%–99.1%。全基因组分析显示，DN12的基因组包含四个复制子，包括一个环状染色体和三个环状质粒pDN-1、pDN-2和pDN-3。该菌株的基因组平均G+C含量为63.2%，预测了5,176个蛋白质编码序列。通过数字DNA-DNA杂交（dDDH）分析，DN12与*S. yanoikuyae* ATCC 51230^T的基因组相似度为72.6%，高于dDDH的物种划分标准（70%）。基于这些结果，我们确定DN12与*S. yanoikuyae* ATCC 51230^T属于同一物种，并将其命名为*S. yanoikuyae* DN12。

### 菌株DN12对BPF的降解能力

在最小盐溶液（MSM）中，菌株DN12能够在6小时内将0.2 mM的BPF降解至检测不到的水平，并在降解过程中观察到菌体生长。这表明DN12能够以BPF作为唯一的碳源和能量来源进行代谢。然而，其他双酚类化合物，如BPA、双酚磺酮（BPS）、四溴双酚A（TBBPA）、四溴双酚S（TBBPS）、2,2-双（4-羟基苯基）丁烷（BPB）、双（4-羟基苯基）乙烷（BPE）和双（4-羟基苯基）硫化物（TDP）则未能被DN12降解。这说明BPF的降解具有一定的特异性。通过底物诱导降解实验，我们发现BPF诱导的菌株DN12在降解BPF的速度上显著高于未诱导菌株，表明BPF降解相关酶具有诱导特性。因此，转录组分析成为进一步探索BPF降解相关基因的有效方法。

### BPF降解过程中产生的代谢产物

高分辨率液相色谱（HPLC）分析表明，菌株DN12在降解BPF过程中产生了三种主要的代谢产物：M1、M2和M3。其中，M1被推测为DHBP，其在质谱图中表现出与DHBP标准品相同的保留时间、质荷比（m/z）和碎片离子特征。M2被鉴定为HPHB，其质谱特征与HPHB标准品一致。M3则被推测为4HB，其质谱图也与标准品相符。这些代谢产物的鉴定为BPF降解途径的进一步研究提供了重要的化学证据。

### BPF降解基因的预测与验证

通过比较转录组分析，我们发现73个转录本在BPF诱导条件下显著上调，占DN12总转录本的约1.3%。其中，48个转录本在BPF诱导菌株与未诱导菌株之间的转录水平上增加超过4倍（log2 fold change = 2）。KEGG通路分析显示，这些上调的基因主要富集于“微生物在多样化环境中的代谢”和“苯甲酸降解”两个通路。进一步分析表明，存在两个重复的基因簇*bpf1*和*bpf2*，分别包含*bpfA1B1*、*bpfC1*和*bpfD1*，以及*bpfA2B2*、*bpfC2*和*bpfD2*。这些基因簇编码的酶具有几乎相同的氨基酸序列，尤其是*bpfA1*和*bpfA2*的序列一致性达到99%，而*bpfB1/BpfB2*、*bpfC1/C2*和*bpfD1/D2*则完全一致（100%）。特别地，*orf5019*（*bpfA1*）和*orf5022*（*bpfA2*）被预测为编码FAD结合氧化还原酶，其序列与flavoprotein亚基PchF的相似性达到43%。PchF与细胞色素c亚基PchC共同构成*p*-甲基苯酚甲基羟化酶（PCMH），该酶催化*p*-甲基苯酚的氧化反应。值得注意的是，*orf5018*和*orf5021*，分别位于*bpfA1*和*bpfA2*的相邻位置，被注释为编码细胞色素c，这进一步支持了*bpfA1B1*和*bpfA2B2*可能负责将BPF转化为DHBP。此外，*orf5015*（*bpfC1*）和*orf5026*（*bpfC2*）被注释为编码FAD依赖的单加氧酶，其序列与*Pseudomonas putida*中的一种单加氧酶的相似性为44%。这表明*bpfC1*和*bpfC2*可能参与DHBP向HPHB的转化。而*orf5016*（*bpfD1*）和*orf5025*（*bpfD2*）被注释为编码α/β水解酶，预计能将HPHB水解为4HB和HQ。这些基因簇的鉴定和功能分析为BPF的生物降解提供了重要的分子基础。

### BpfAB基因簇的功能分析

BpfAB基因簇编码的氧化还原酶负责将BPF转化为DHBP。通过BLASTP搜索NCBI数据库，我们发现有10种蛋白质与BpfA具有≥38%的氨基酸序列同源性。BpfA与*S. yanoikuyae* SJTF8中的FAD结合氧化还原酶的同源性最高（100%），但尚未有对其功能的研究。在已知的蛋白质中，BpfA与*P. putida* NCIMB 9869中的PCMH（PchF）的同源性为43%，其次是*G. metallireducens* GS-15中的PcmI（41%）和PcmJ（39%）。PCMH是一种已知的双组分氧化还原酶，其催化机制在*Pseudomonas*和*Geobacter*物种中已被阐明。我们进一步通过SDS-PAGE分析了BpfA和BpfB的分子量，分别为约58.8 kDa和13.9 kDa，与理论值一致。紫外-可见光谱分析显示，纯化的BpfAB在280 nm处表现出强烈的蛋白质吸收峰，并在375 nm和450 nm处显示出FAD特异性峰。定量分析表明，每1 μM的蛋白复合物含有约0.4 μM的FAD。而血红素的结合则较少，未观察到特征性的Soret峰（410 nm），但3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）染色显示BpfAB存在较弱的阳性条带，而BpfA（阴性对照）则未显示，而细胞色素c标准品（阳性对照）则表现出明显的阳性条带。这表明大部分BpfB亚基在*E. coli*中以无血红素形式存在，仅有少量血红素结合。

BpfAB在pH 8.0和55°C时表现出最佳活性，其在pH 6.0–9.0和温度45°C–65°C范围内保持高活性。其稳态动力学参数显示，BPF的* K*_m为19.30±6.66 μM，* k*_cat为0.79±0.08 s^?1。通过同位素标记实验，我们进一步确认了BpfAB催化反应中羟基氧的来源。在无氧、有氧和¹⁸O₂标记条件下，DHBP的分子离子峰均出现在*m/z* 213.0557，而在无氧H₂¹⁸O标记条件下，DHBP的*m/z*发生+2的偏移，显示为215.0604。这表明DHBP中的羟基氧来源于水而非分子氧。进一步的代谢分析显示，双（4-羟基苯基）甲醇是BPF转化为DHBP的关键中间产物。该中间产物在H₂¹⁸O标记组中也表现出*m/z*的+2偏移，表明DHBP的形成涉及多个连续步骤。结合已知的PCMH模型，我们推测这一过程可能涉及BPF-醌中间体的短暂形成，随后被水分子攻击以生成羟基化产物。此外，BpfAB在无氧和有氧条件下的比活性分别为0.12 U/mg和0.14 U/mg，差异不显著（*P* > 0.05），进一步支持了羟基化步骤与分子氧无关。这些发现表明，在BpfAB催化的反应中，DHBP中的氧原子来源于水。

为了更深入地了解BpfA的进化关系和栖息地分布，我们分析了333个来自原核生物基因组的BpfA同源蛋白。系统发育分析显示，这些BpfA编码的物种主要属于假单胞菌门（Pseudomonadota），占93%（303个基因组）。其中，*Burkholderiaceae*（63%）和*Sphingomonadaceae*（12%）尤为突出，表明这些菌种在BPF胁迫环境中具有更强的竞争力。栖息地分布分析显示，编码BpfA同源蛋白的物种广泛分布于陆地和水生环境，其中46%与土壤相关。尽管本研究中的BpfA编码物种来源于水生环境，但其在土壤中的显著存在突显了这些生物在生态中的重要性。此外，与BpfA有亲缘关系的基因组显示，即使来自不同的环境，它们也表现出高度保守的BpfA同源蛋白，反映了这些基因的进化稳定性及其在维持功能适应性中的垂直遗传特征。

### BpfC基因的功能验证

BpfC是一种FAD依赖的单加氧酶，编码于*bpfC1*基因（1,209 bp），由402个氨基酸组成。SDS-PAGE分析显示，BpfC的分子量约为45.7 kDa。其最佳活性出现在pH 8.5和40°C，且在pH 5.0–9.0和温度35°C–50°C范围内保持高活性。其稳态动力学参数显示，DHBP的* K*_m为21.31±2.88 μM，* k*_cat为2.70±0.13 s^?1。BpfC催化DHBP向HPHB的转化，这是一种典型的拜耳-维里格重排反应，其中酮基被氧化为相应的酯。为了追踪HPHB中氧原子的来源，我们分别使用H₂¹⁸O和¹⁸O₂进行同位素标记实验。HRMS分析显示，HPHB的分子离子峰在无氧、有氧和¹⁸O₂标记条件下均出现在*m/z* 229.0506，而在H₂¹⁸O标记组中，HPHB的*m/z*发生+2的偏移（从229.0504到231.0551），表明HPHB中的氧原子来源于分子氧。时间进程实验显示，在有氧条件下，BpfC催化DHBP向HPHB的逐步转化，而在无氧条件下（N₂气泡），仅在前5分钟检测到少量HPHB（约5 μM），随后产物积累停止。此外，BpfC在有氧条件下的比活性为0.17 U/mg，显著高于无氧条件下的0.05 U/mg（*P* < 0.05）。这可能归因于氮气置换过程中残留的氧气。这些结果表明，BpfC催化的拜耳-维里格氧化反应依赖于分子氧。

目前，已鉴定的三种类型单加氧酶包括类型I（FAD依赖的单加氧酶）、类型II（FMN依赖的单加氧酶）以及非典型单加氧酶（FAD依赖，但缺乏类型I的典型序列，并能催化多种氧化反应）。系统发育分析显示，BpfC是类型I单加氧酶的新成员。此外，保守结构域分析表明，BpfC包含一个保守的Rossmann折叠FAD结合结构域（GxGxxG/A）以及两个典型的类型I单加氧酶结构域（G/AGxWxxxxF/YPG/MxxxD和FxGxxxHxxxWP/D）。这进一步确认了BpfC确实是类型I单加氧酶。

### BpfD基因的功能验证

BpfD编码于*bpfD1*基因（906 bp），由301个氨基酸组成。SDS-PAGE分析显示，BpfD的分子量约为32.9 kDa。通过BLASTP搜索Swiss-Prot数据库，我们发现有七种蛋白质与BpfD具有≥24%的序列一致性，均属于α/β水解酶折叠家族。体外酶活性实验显示，BpfD催化HPHB向4HB和HQ的转化。BpfD的最佳活性出现在pH 9.0–9.5和40°C，并在pH 7.5–10.5和温度25°C–50°C范围内保持高活性。其稳态动力学参数显示，HPHB的* K*_m为22.54±5.21 μM，* k*_cat为40.24±0.23 s^?1。BpfD通过催化复杂化合物的水解，将其转化为更简单的芳香族代谢物，从而促进BPF的进一步矿化。

序列和系统发育分析表明，BpfD属于α/β水解酶家族。BpfD包含一个保守的GxSxG结构域（第100–105位残基），这是该家族催化位点的特征。此外，BpfD还包含经典的催化三联体Ser102-Asp247-His275。这些特征表明，BpfD在BPF代谢途径中起着重要作用，通过催化复杂化合物的水解，将其转化为更简单的芳香族代谢物，从而促进BPF的进一步矿化。

### 研究的意义与展望

本研究不仅揭示了BPF的降解途径，还提供了分子层面的证据，证明BPF通过BpfAB、BpfC和BpfD三个关键酶的协同作用被逐步转化为DHBP、HPHB和最终产物4HB与HQ。这一过程涉及氧化、氧化和水解三个关键步骤，揭示了BPF降解的复杂机制。此外，我们发现BpfAB具有独特的FAD结合方式，与经典的PCMH不同，这表明PCMH样酶不仅限于小分子芳香族底物，如*p*-甲基苯酚，还能催化结构复杂的合成双酚。这些发现为微生物消除双酚污染提供了新的分子基础，并拓展了该酶家族的催化能力。

通过本研究，我们对BPF降解的分子机制有了更深入的理解，同时也为未来的环境治理技术提供了重要的理论支持。未来的研究可以进一步探索这些酶在不同环境条件下的活性与稳定性，以及它们在实际应用中的表现。此外，可以研究这些酶在其他双酚类污染物中的潜在作用，以拓展其在生物修复领域的应用范围。本研究的结果表明，微生物在处理环境污染物方面具有重要的潜力，而深入理解这些酶的催化机制将有助于开发更高效、环保的污染治理策略。