SARS-CoV-2多聚蛋白的表达与双膜囊泡的诱导

《Journal of Virology》：SARS-CoV-2 polyprotein expression and the induction of double-membrane vesicles

本研究建立了SARS-CoV-2多聚蛋白表达系统模拟DMV形成，发现nsp3-10表达导致DMV尺寸增大和形态异质性增强。通过蛋白切割抑制和蛋白酶K保护实验，证实nsp3/4切割是DMV形成的必需步骤，而nsp6膜相关结构域（MAE）突变显著抑制DMV组装并诱导异常内质网结构。该系统为解析病毒复制转录复合体（RTC）招募机制提供了新工具。

　　冠状病毒是一种重要的新兴和再兴传染病原体，其中由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（冠状病毒疾病2019，简称COVID-19）对全球社会和经济造成了严重影响。尽管直接作用的抗病毒药物（DAAs），如病毒聚合酶抑制剂和病毒蛋白酶抑制剂，已在治疗新冠状病毒肺炎中展现出一定的治疗潜力，但仍然存在高度有效且具有新作用机制的抗病毒药物的迫切需求。这种药物的开发将有助于扩大和增强现有的抗病毒药物库，从而改善治疗效果，并提供对新出现的冠状病毒及其变种的更广泛活性。

冠状病毒是正链单链RNA病毒，其基因组编码一个开放阅读框（ORF1a），产生一个称为pp1a的多聚蛋白（非结构蛋白1-10，nsp1-10）。ORF1a内的核糖体介导的移码翻译促进了ORF1b的翻译，从而合成pp1ab多聚蛋白，该蛋白随后被两种病毒的半胱氨酸蛋白酶（PLpro和3CLpro或Mpro）处理成nsp1-16非结构蛋白。冠状病毒通过其非结构蛋白重塑内质网（ER），形成双层膜囊泡（DMVs），这些囊泡被认为是病毒复制和转录的主要场所。复制转录复合体（RTC）是介于病毒非结构蛋白nsp2到nsp16以及核衣壳蛋白之间的多蛋白复合体，其主要在DMVs中进行复制和转录活动。

尽管已知nsp3和nsp4是形成DMVs的最小必要组件，但其他非结构蛋白在DMVs生物合成和RTC组分招募中的功能贡献仍未完全阐明。此外，nsp6，一种多跨膜蛋白，在DMVs生物合成中的具体作用仍然存在争议。一些研究表明，nsp6可能通过调节脂质代谢在DMVs形成中起调控作用。我们之前鉴定出nsp6 C末端的一个高度保守的膜相关元件（MAE），该元件对于病毒复制至关重要。然而，MAE在DMVs形成中的具体作用仍需进一步研究。为此，我们建立了一个能够表达nsp3到nsp10多聚蛋白的系统，并利用该系统探讨MAE对DMVs形成的影响。我们引入了nsp6 MAE的非功能突变（MH：I266A，F269A，I273A，L276A）至nsp3-10-GFP表达系统，得到nsp3-10-GFP.MH质粒。结果显示，这些突变显著降低了nsp5的蛋白酶处理效率，同时减少了DMVs的形成，并导致异常的内质网（ER）结构。

我们进一步研究了nsp3和nsp4的蛋白酶处理对DMVs形成的影响。通过使用催化活性缺失的突变体，我们发现nsp3的PLpro活性对于DMVs的形成至关重要，而nsp5的Mpro活性则并非必需。在nsp3-8-GFP.C856A（PLpro活性缺失）条件下，细胞未能形成DMVs，而是形成了扩展的膜片，这表明PLpro的活性在DMVs的形成中起关键作用。相反，nsp3-8-GFP.C145A（Mpro活性缺失）细胞形成了与野生型相似大小的DMVs，尽管形态异质性有所增加，这表明Mpro的活性在DMVs形成中不是必需的。这些发现表明，虽然nsp3和nsp4的处理对于DMVs的形成至关重要，但其他非结构蛋白的处理可能对DMVs的形态和大小有调节作用。

为了进一步了解DMVs的形成和RTC组分的招募，我们建立了一个人工表达系统，该系统能够独立于病毒复制来诱导DMVs的形成。我们使用了多种不同的nsp组合，并评估了不同构建体诱导的DMVs的数量和大小。结果显示，表达nsp3-8-GFP和nsp3-10-GFP的细胞形成的DMVs比表达nsp3-4-GFP的细胞形成的DMVs更大且更异质。这表明，nsp5-8和nsp5-10可能在调节DMVs的大小和形态方面发挥重要作用。此外，我们还通过蛋白酶K（PK）保护实验，研究了不同nsp组合在细胞中的定位。结果显示，部分nsp5、nsp7和nsp8与DMV相关的膜部分有关，并且对PK的消化具有部分抵抗力，这表明这些蛋白可能位于DMV内部或受到DMV膜结构的保护。

我们还发现，nsp6的MAE突变显著影响了nsp5的蛋白酶处理，并导致DMVs形成减少，同时诱导了异常的ER结构。这些结果表明，nsp6的MAE在DMVs的形成中起着关键作用。通过比较不同突变体的DMVs形成情况，我们进一步确认了PLpro和Mpro在DMVs形成中的不同作用。PLpro的活性对于DMVs的形成至关重要，而Mpro的活性则并非必需。这些发现为理解冠状病毒诱导的膜重塑提供了重要的线索，并为开发针对冠状病毒的新抗病毒策略提供了理论依据。

在本研究中，我们建立了一个能够独立于病毒复制诱导DMVs形成的系统，为病毒蛋白的功能研究提供了新的平台。通过该系统，我们确认了nsp6的MAE在DMVs形成中的关键作用，并探讨了不同蛋白酶处理事件对DMVs形成的影响。这些研究结果不仅加深了我们对冠状病毒复制机制的理解，也为未来的抗病毒药物开发提供了新的方向。此外，我们还发现，尽管某些蛋白酶处理事件对DMVs形成有影响，但其他处理事件可能在调控膜结构方面起着更关键的作用。这些发现有助于揭示冠状病毒如何通过其非结构蛋白的相互作用和处理来重塑宿主细胞膜，从而为抗病毒药物的设计提供了新的思路。