用于检测下呼吸道样本中肺孢子虫（Pneumocystis jirovecii）的实时聚合酶链反应（PCR）

《Microbiology Spectrum》：Real-time polymerase chain reaction (PCR) for Pneumocystis jirovecii detection in lower respiratory tract samples

贾第酵母菌肺炎（PjP）的诊断目前依赖直接显微镜检查（ME），但灵敏度低且无法区分定植与感染。本研究比较了qPCR法与ME的诊断性能，通过163例样本分析发现qPCR在ME阳性样本中完全一致，21例ME阴性样本中qPCR呈阳性。ROC曲线分析显示，当cut-off值为150 DNA copies/10^5 cells时，qPCR的灵敏度和特异性分别为100%和99%。此外，通过β2-微球蛋白归一化细胞DNA含量，可更标准化地表达真菌载量，为感染与定植的区分提供依据。

　　本文探讨了在诊断Pneumocystis jirovecii肺炎（PjP）时，定量实时聚合酶链反应（qPCR）方法相较于传统直接显微镜检查（ME）的诊断价值和应用前景。P. jirovecii是一种机会性真菌，属于子囊菌门，主要通过空气传播，是PjP的病原体。PjP以间质性肺炎为特征，常伴有发热、无痰咳嗽和呼吸困难等症状。该病主要影响免疫功能低下的个体，如器官移植患者或血液系统恶性肿瘤患者，同时也在某些免疫功能正常的个体中被发现，如儿童、老年人及医护人员等。由于P. jirovecii与肺上皮细胞密切相关，其DNA含量在不同样本中的变化可能受到宿主细胞数量的影响，因此，通过标准化方法区分感染与定植具有重要意义。

研究团队对163份来自不同部门的患者样本进行了分析，这些样本包括支气管肺泡灌洗液（BAL）和痰液，且已通过ME进行过P. jirovecii的检测。所有63份ME阳性样本均被qPCR确认，而100份ME阴性样本中有21份（21%）在qPCR中呈阳性。这表明qPCR具有更高的灵敏度，能够检测到ME未能发现的低水平真菌DNA。为了评估qPCR的诊断效能，研究团队采用受试者工作特征（ROC）曲线分析，确定了最佳的诊断阈值。当以每毫升样本中的DNA拷贝数为指标时，4,000拷贝/mL的阈值表现出99%的特异性和98%的灵敏度；而当以每100,000个宿主细胞中的DNA拷贝数为指标时，150拷贝/100,000细胞的阈值显示出100%的灵敏度和99%的特异性。这一标准化方法有助于更准确地区分感染与定植，提高诊断的可靠性。

在临床实践中，ME仍然是PjP诊断的黄金标准，但其灵敏度较低，且难以区分定植与感染。相比之下，qPCR因其高灵敏度和特异性，成为一种更有潜力的诊断工具。然而，由于其结果可能受到样本细胞数量的影响，因此需要通过标准化方法来评估真菌DNA的负荷。本研究中，通过测量β2-微球蛋白的含量，对样本中的细胞DNA进行标准化，从而获得更准确的真菌DNA拷贝数/细胞的表达。这种方法不仅提高了检测的标准化程度，还可能有助于在样本质量不理想的情况下识别高风险和低风险病例。

研究结果显示，qPCR在检测P. jirovecii时表现出较高的准确性，尤其是在那些ME未能检测到但实际存在感染的患者中。对于在100至300拷贝/100,000细胞之间的样本，由于无法明确区分感染与定植，建议结合临床评估进行判断。在本研究中，仅有2名患者（1.2%）位于这一临界区域，其中一名为HIV-AIDS患者，另一名为免疫功能正常的疑似肿瘤患者。这提示我们，在临床诊断中，需综合考虑患者的免疫状态、临床表现和影像学检查结果，以提高诊断的准确性。

尽管qPCR在诊断PjP方面表现出色，但其仍存在一些局限性。首先，由于P. jirovecii的囊状形态可能与上皮细胞无关，因此基于β2-微球蛋白的标准化方法可能会导致对真菌负荷的高估。其次，样本量相对较小，限制了研究结果的普遍适用性。未来的研究需要进一步扩大样本量，并与其他机构合作以验证该方法的稳定性。此外，研究还指出，P. jirovecii定植在免疫功能正常的个体中可能对流行病学研究具有一定的参考价值，但对临床治疗决策的影响尚不明确。

本研究强调了qPCR在临床诊断中的重要性，尤其是在那些无法进行BAL采集或痰液样本的患者中。对于高风险患者，如HIV感染者、器官移植受者或血液系统恶性肿瘤患者，qPCR可以作为ME的有力补充，提高诊断的准确性和及时性。然而，对于临界区的样本，仍需结合其他诊断手段，如ME和影像学检查，以避免误诊。研究团队建议，在临床实践中，应根据患者的具体情况和样本特性，合理选择和应用qPCR技术，以确保诊断的可靠性和有效性。

综上所述，本研究为qPCR在PjP诊断中的应用提供了新的视角和数据支持。通过引入基于宿主细胞DNA的标准化方法，研究团队不仅提高了检测的准确性，还为未来的研究和临床实践奠定了基础。随着分子诊断技术的不断发展，qPCR有望成为PjP诊断的重要工具，特别是在提高诊断灵敏度和特异性方面。然而，进一步的研究和多中心合作仍然是必要的，以确保该方法在不同临床环境中的适用性和可靠性。