利用鸟枪法宏基因组学以及对16S代谢条形码的比较分析，对用于表征人体皮肤微生物组的方案进行评估

《Microbiology Spectrum》：Assessment of protocols for characterization of the human skin microbiome using shotgun metagenomics and comparative analysis with 16S metabarcoding

皮肤微生物组分析比较了shotgun测序与16S rRNA测序的性能，发现优化采样（D-Squame）和提取（MGP协议）显著提升DNA产量，而MDA扩增导致taxonomic偏差。额头以Cutibacterium为主，腋下以Staphylococcus为主，shotgun测序能检测病毒和真菌，并揭示代谢差异。

　　人类皮肤微生物群是皮肤健康的重要组成部分，包含多种微生物，如细菌、真菌和病毒，其组成因身体部位的不同而存在显著差异。尽管16S rRNA基因测序技术在微生物组研究中被广泛应用，但它仅限于检测原核生物，并且提供的功能信息有限。相比之下，宏基因组测序能够更全面地揭示微生物群的组成和功能潜力，但其在低生物量皮肤样本中面临一定的技术挑战，例如微生物DNA含量较低以及宿主污染较高。因此，本研究旨在通过优化采样和DNA提取方法，提高宏基因组测序的成功率，并评估其在皮肤微生物组研究中的适用性。

研究选取了40名健康志愿者，分别从额头和腋窝部位采集样本，并使用不同的采样工具和DNA提取方法进行比较。结果显示，D-Squame圆盘相较于OMNIgene SKIN采集工具，能够获得更高的DNA产量。此外，一种内部开发的DNA提取方法（MGP协议）在DNA提取效率方面表现尤为突出，相较于商业试剂盒（如DNeasy PowerSoil和QIAamp PowerFecal）能够显著提高DNA的提取量。尽管如此，由于皮肤样本的生物量较低，提取的DNA总量仍然有限，通常仅为几纳克，远低于宏基因组测序所需的最低要求。因此，研究者采用了多重置换扩增（MDA）技术来增加DNA的可用量，从而提高测序成功率。然而，MDA在实际应用中引入了显著的组成偏差，导致微生物群落结构的多样性降低。基于此，最终分析仅采用未经过MDA处理的样本，虽然这使得部分样本因微生物DNA含量不足而被排除。

在微生物群落的组成分析中，研究发现额头和腋窝样本分别以Cutibacterium spp.和Staphylococcus spp.为主导。这一结果与以往研究一致，进一步说明了皮肤不同区域的微生物组成存在显著差异。例如，额头区域的微生物群落显示出较高的多样性，而腋窝区域则表现出更均匀的物种分布。此外，研究还发现，尽管DNA提取方法对微生物群落的多样性有一定影响，但这种影响远不及采样部位的差异。在微生物丰度分析中，一些真菌如Malassezia globosa和Malassezia restricta在额头样本中被检测到，而这些真菌通常与皮肤的脂质代谢相关。同时，病毒组分析揭示了皮肤微生物群中病毒的组成，包括大量与细菌共生的噬菌体以及一些与人类细胞相关的乳头瘤病毒。

在功能潜力方面，额头和腋窝样本展现出不同的代谢特征。额头样本中检测到与脂质代谢相关的基因家族，尤其是涉及角鲨烯和神经酰胺代谢的基因，这与额头作为皮脂腺丰富的区域有关。这些基因的高丰度可能与Malassezia spp.的代谢活动密切相关，它们能够利用皮肤中的脂质作为生长和繁殖的营养来源。而腋窝样本中则检测到与精胺代谢相关的基因，这些基因可能与局部的微生物功能和体味产生有关。此外，研究还发现一些与抗生素耐药性相关的基因在腋窝样本中更为丰富，这可能与Staphylococcus spp.的广泛分布和其在人类皮肤中的适应性有关。

与16S rRNA基因测序相比，宏基因组测序不仅能够提供更全面的微生物信息，还能揭示微生物群落的潜在功能。然而，由于两种方法依赖于不同的分类数据库（如GTDB用于宏基因组测序，SILVA用于16S测序），在直接比较两者结果时可能会出现偏差。尽管如此，研究发现宏基因组测序在某些关键基因家族的丰度上与16S测序结果存在显著差异，尤其是在Staphylococcus spp.的丰度方面。这可能与16S测序中16S rRNA基因拷贝数的差异以及DNA提取过程中对不同微生物的处理效率有关。此外，宏基因组测序能够检测到更多的病毒和真菌序列，这为全面理解皮肤微生物组提供了新的视角。

研究结果表明，宏基因组测序在低生物量皮肤样本中具有重要的应用潜力，但其成功依赖于优化的采样和DNA提取流程。D-Squame圆盘和MGP协议的组合被证明是最有效的DNA提取方法，能够在最大程度上减少宿主DNA的污染并提高微生物DNA的提取量。同时，MDA技术虽然能够提升测序成功率，但其引入的偏差可能会掩盖真实的微生物群落结构，因此在实际应用中应谨慎使用。研究还强调了不同皮肤区域的微生物群落具有显著的生理和生态特征，这为未来的临床研究提供了重要的参考依据。

在功能分析方面，研究揭示了微生物群落中与疾病相关的关键基因家族。例如，Cutibacterium acnes的某些毒力因子，如卟啉代谢相关基因、唾液酸酶和透明质酸酶，可能与痤疮的发生密切相关。这些基因的丰度在额头样本中较高，反映了该区域微生物的特殊功能和代谢活动。此外，腋窝样本中与体味相关的基因，如cysteine-conjugate beta lyase（patB），被发现与Staphylococcus spp.密切相关，这可能解释了腋窝区域特有的气味特征。这些发现不仅加深了我们对皮肤微生物功能的理解，也为相关疾病的预防和治疗提供了新的思路。

本研究的结论表明，宏基因组测序在全面分析皮肤微生物组方面具有明显优势，尤其是在检测非原核微生物和揭示微生物的功能潜力方面。然而，由于皮肤样本的生物量较低，优化采样和DNA提取方法对于提高测序成功率至关重要。此外，MDA技术虽然能够提升DNA的可用性，但其对微生物群落结构的干扰需要进一步评估。研究还指出，未来的研究应关注皮肤微生物群在不同生理状态下的变化，如在痤疮、湿疹等皮肤疾病中的表现，以进一步揭示其在人体健康中的作用。同时，随着测序技术的不断进步，宏基因组测序有望成为皮肤微生物组研究的重要工具，为个性化医疗和皮肤健康干预提供更深入的数据支持。