在一场噬菌体生物学培训课程中分离出的五种感染大肠杆菌K-12的环境噬菌体的特性研究

《Microbiology Spectrum》：Characterization of five environmental phages infecting Escherichia coli K-12 isolated during a phage biology training course

噬菌体分离与抗菌防御系统互作研究。2023年Lund大学课程中，利用能动E. coli BW25113 IS5菌株从水样中分离出五种噬菌体（LuPh1-5），包括属级新种LuPh3-4。通过TEM确认其形态学特征（myovirus和siphovirus），基因组分析显示LuPh5属Chivirus。抗性测试表明LuPh1-2受CmdTAC抑制，LuPh5受EcoRI和AbiK限制，所有噬菌体对人工合成的CmdTA-HigC系统敏感。研究拓展了噬菌体资源库，证实了菌株机动性对噬菌体宿主范围的影响，为后续机制研究奠定基础。

　　在当今生物科学领域，噬菌体（bacteriophages）作为一种天然存在的病毒，因其独特的生物学特性和在基因研究、生物技术及医学领域的广泛应用而受到越来越多的关注。噬菌体不仅是细菌基因组研究的重要工具，而且在探索细菌防御系统及其对抗噬菌体的策略中扮演着关键角色。本文通过2023年在隆德大学举办的《基础与应用噬菌体生物学原理》课程，报告了五种环境来源的埃希氏菌（*Escherichia coli*）噬菌体的分离、表征及基因组注释结果。这些噬菌体被命名为Lubas（LuPh1）、Lucat（LuPh2）、Lupin（LuPh3）、Lucris（LuPh4）和Kompetensportalen（LuPh5），分别归属于*Tequatrovirus*、*Tequintavirus*和*Chivirus*三个属。通过透射电镜（TEM）确认了这些噬菌体的形态特征，例如长收缩尾的myoviruses和长柔韧非收缩尾的siphoviruses，这些特征与它们所属的属高度一致。同时，研究还揭示了这些噬菌体对多种已知的细菌抗噬菌体防御系统的敏感性，为后续研究提供了重要的参考资源。

噬菌体的分离过程通常依赖于合适的宿主菌株。在本研究中，研究人员选择了一种具有运动能力的*E. coli* K-12 BW25113菌株作为宿主，该菌株的运动能力源于在*flhDC*基因簇上游插入的IS5转座子。*flhDC*基因簇是控制鞭毛合成的主调控因子，因此IS5的插入显著提高了该菌株的运动能力。研究人员还比较了另一种缺乏IS5插入的非运动型BW25113菌株（VHB987）和运动型菌株（VHB17）的基因组，发现除了IS5插入和一个沉默的*dnaE*基因突变外，两者在基因组上几乎完全一致。这一发现表明，运动能力的差异主要由IS5插入导致，而非其他基因变异。此外，研究还发现，某些噬菌体具有旗螺性（flagellotropic）特性，即它们优先感染具有鞭毛的细菌，因此选择运动型菌株作为宿主对于成功分离这些噬菌体至关重要。

研究团队从隆德大学植物园的多个小型池塘中采集了环境水样，并通过一系列标准步骤进行处理，包括去除杂质、浓缩噬菌体、使用顶层琼脂覆盖法（top agar overlay method）筛选噬菌体。通过连续划线纯化单个噬菌体斑，最终获得了12种噬菌体，其中五种具有独特的基因组序列。这些噬菌体的基因组大小从60,000到167,000碱基对不等，编码的基因数量也有所不同。通过比较这些噬菌体与NCBI数据库中已知的其他噬菌体，研究人员确定了它们的分类归属，并发现其中三种属于新发现的物种。这一发现不仅丰富了现有噬菌体数据库，也为研究细菌抗噬菌体防御系统提供了新的工具。

进一步的实验结果显示，这些噬菌体对多种抗噬菌体防御系统表现出不同的敏感性。例如，LuPh1和LuPh2对CmdTAC系统表现出显著的抗性，而LuPh5则对EcoRI限制修饰系统和AbiK反向转录酶系统敏感。此外，所有五种噬菌体均对人工构建的CmdTA-HigC混合系统表现出高度敏感性，这表明该系统具有广泛的抗噬菌体作用。值得注意的是，LuPh5在感染缺乏IS5插入的非运动型BW2513菌株时无法形成噬菌斑，而能够感染运动型的*Salmonella* Typhimurium菌株，这进一步支持了其作为*Chivirus*属成员的分类，并揭示了其依赖于细菌运动能力的感染机制。

本研究的发现不仅有助于深入理解噬菌体与宿主之间的相互作用，也为噬菌体在生物技术、医学和教育领域的应用提供了新的可能性。通过在实际教学过程中引入噬菌体分离技术，研究人员不仅为学生提供了宝贵的实践经验，还为后续研究积累了重要的实验材料。这些噬菌体可以作为工具，用于测试和验证不同的抗噬菌体防御系统，从而推动相关研究的进展。此外，研究还强调了噬菌体分离在课程实践中的教育价值，表明通过动手实验，学生能够更直观地理解噬菌体生物学的基本原理，并掌握相关的实验技能。

在方法学方面，本研究采用了多种先进的技术手段，包括基因组测序、基因注释和可视化分析。研究人员使用了Illumina和Oxford Nanopore两种测序技术，以确保基因组数据的准确性和完整性。通过这些技术，他们不仅验证了宿主菌株的基因组特征，还成功地对噬菌体的基因组进行了注释，并利用LoVis4u工具对基因组的结构和功能进行了深入分析。这些数据为进一步的噬菌体研究奠定了坚实的基础，同时也展示了现代生物技术在微生物学研究中的强大应用潜力。

研究还通过透射电镜对噬菌体的形态进行了详细观察，揭示了它们的结构特征，如长收缩尾的myoviruses和长柔韧非收缩尾的siphoviruses。这些形态特征不仅有助于噬菌体的分类，也为理解它们的感染机制提供了线索。例如，LuPh5的感染能力受限于宿主的运动性，这可能与其依赖于鞭毛作为感染入口的特性有关。此外，研究还通过液态培养感染实验评估了噬菌体的裂解活性，发现LuPh5的裂解过程相较于其他噬菌体有所延迟，这可能与其较长的潜伏期或对宿主运动性的依赖有关。

本研究的意义在于，它不仅展示了噬菌体在细菌抗病毒防御系统研究中的重要性，还强调了在教育实践中引入噬菌体分离和研究的必要性。通过课程实践，学生能够接触到真实的科研流程，从样本采集到基因组测序，再到功能分析和抗性测试，这为培养新一代的科研人员提供了宝贵的经验。此外，研究还揭示了不同噬菌体对多种抗噬菌体系统的反应差异，这为开发新的噬菌体疗法和抗病毒策略提供了重要的数据支持。

总的来说，本研究通过系统地分离和表征五种环境来源的*E. coli*噬菌体，不仅丰富了噬菌体资源库，还为理解噬菌体与细菌之间的相互作用提供了新的视角。研究结果表明，噬菌体的分离和研究可以作为教学和科研的重要工具，为探索细菌防御机制和噬菌体反防御策略提供了宝贵的材料。未来的研究可以进一步探讨这些噬菌体的宿主范围、感染机制以及在实际应用中的潜力，为噬菌体在医学和生物技术中的广泛应用提供更深入的理论和实践基础。