从对免疫疗法完全响应的黑色素瘤患者的粪便样本中分离出的Catenibacterium mistuoki的基因组序列草图

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genome sequence of Catenibacterium mistuoki isolated from the fecal sample of a melanoma patient with complete response to immunotherapy

Catenibacterium spp.菌株从乌拉圭一名IV期黑色素瘤患者的粪便中分离，患者自2016年接受Pembrolizumab免疫检查点抑制剂治疗后持续完全缓解。通过Illumina NovaSeq SP平台和Oxford Nanopore测序技术获得基因组数据，SPAdes组装后得到114条contig，总长2248535bp。基因组经GTDB-Tk分类，与C. mitsoukai ANI 95.66匹配。使用MinKNOW和Bream进行数据过滤与组装，最终构建的杂交基因组经QUAST评估，完整度达97.6%。

　　

摘要

2008年12月，从一名被诊断为IV期黑色素瘤患者的粪便样本中分离出一种Catenibacterium属细菌。该患者于2016年5月开始接受免疫检查点抑制剂pembrolizumab的治疗，并且自那时起对治疗表现出持续的完全反应。

公告

Catenibacterium是一种革兰氏阳性、不形成孢子的厌氧菌，属于Erysipelotrichidae科。迄今为止，根据《国际原核生物命名法规》，仅有一种物种被正式命名：Catenibacterium mistuoki，它最初是从生活在巴布亚新几内亚高海拔地区居民的粪便中分离出来的（1）。此外，还发现了一个亚种：Catenibacterium tridentinum（2）。

Catenibacterium mistuoki菌株是在乌拉圭一名IV期黑色素瘤患者的粪便中，在厌氧环境中（95% N₂/5% H₂）分离出来的。新鲜样本在PBS中匀浆后进行系列稀释，以10^-5和10^-6的浓度接种到YCFA琼脂培养基上。在37°C下培养2天后，将单个菌落接种到YCFA液体培养基中，并再在37°C下培养24小时。YCFA培养基按照标准配方自行制备（3）。

使用Thermo Fisher Scientific公司的PureLink DNA Purification Kit按照制造商的标准方案从液体培养物中提取基因组DNA。在制备文库之前，使用Qubit dsDNA Quantification Assay Kit（Thermo Fisher Scientific公司）评估了提取DNA的质量和数量。全基因组测序（WGS）采用了Illumina和Oxford Nanopore两种技术。Illumina测序在Wellcome Sanger Institute（英国欣克斯顿）的NovaSeq SP平台上进行。文库的制备遵循该研究所为NovaSeq SP平台制定的标准方案，未作任何修改。测序产生的配对末端读长为151 bp，共获得约161万个配对末端读段（约210 Mbp），GC含量为33%。使用FastQC v0.12.1软件评估了读段质量（4）。根据FastQC分析，Illumina数据集包含约139万个读段，总长度为210 Mbp，GC含量为33%。所有生物信息学工具均使用默认参数运行。基因组组装使用SPAdes v3.15.5完成（5），并使用QUAST v5.2.0评估了组装质量（6）。最终组装的基因组总长度为2,248,535个碱基对，包含114个contig。

Oxford Nanopore测序在蒙得维的亚巴斯德研究所的CiVE（Centro de Innovación en Vigilancia Epidemiológica）进行。基因组DNA使用g-TUBEs（Covaris公司）进行剪切，然后以6,000 RPM的速度离心60秒，得到约10 kb大小的片段。根据制造商的说明，使用Oxford Nanopore Technologies的Native Barcoding Kit SQK-NBD114.24试剂盒进行文库制备。测序在GridION仪器上使用FLO-MIN106D流动池完成。碱基调用采用高精度模型v3.3（450 bps），最小Q分数为9。使用的软件版本包括：MinKNOW v24.11.8、Bream v8.2.5、Configuration v6.2.12、Dorado v7.6.7和MinKNOW Core v6.2.6。原始数据使用NanoFIlt v2.8.0（7）进行过滤，参数设置如下：最小平均质量分数为8，最小读长为200 bp，以及从每个读段的5′和3′端各修剪70个碱基。过滤后，剩余1,327个长读段，平均读长为3,334 bp，平均质量分数为11.3，ONT读段N50为39,664 bp。过滤后的Nanopore读段使用Minimap2 v2.26（8）与基于SPAdes v3.15.5的Illumina组装结果对齐。得到的SAM文件直接用于Racon v1.4.20（9）进行一轮优化处理。优化后的混合组装结果使用QUAST v5.2.0进行评估（表1（6）。

表1

表1 使用QUAST v5.2.0生成的优化混合基因组的组装统计信息

组装情况
Contigs（≥ 0 bp）	50
Contigs（>1,000 bp）	50
Contigs（>5,000 bp）	42
Contigs（>10,000 bp）	38
Contigs（>25,000 bp）	30
Contigs（>50,000 bp）	18
总长度（≥ 0 bp）	2,134,571
总长度（>1,000 bp）	2,134,571
总长度（>5,000 bp）	2,134,571

使用GTDB-Tk v2.4.1和r226版本的数据库（10）进行分类。该基因组被归类为Catenibacterium属，其最近的同源参考菌株为C. mitsoukai（ANI相似度为95.66，与GCA_964259225.1相比）。

使用GenoVi 0.4.3（11）进行基因组可视化，生成了组装基因组的圆形图谱（图1）。Genovi图谱展示了包括GC含量、GC偏斜率以及contigs上的预测编码序列在内的特征。

图1

图1 使用GenoVi 0.4.3生成的Catenibacterium属圆形基因组图谱，展示了GC含量、GC偏斜率以及contigs上的预测编码序列。

致谢

我们衷心感谢Wellcome Sanger研究所的Trevor Lawley、Yan Shao、Hilary Browne和Mark Stares在测序工作中给予的支持。

本项工作得到了阿根廷国家研究创新机构（ANII）的FSGSK_1_2019_1_159735项目资助，以及GSK和FOCEM—南美结构融合基金（COF 03/11）的资助。