《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequences of two Klebsiella pneumoniae bacteriophages in genus Marfavirus
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Klebsiella肺炎单胞菌耐药性问题及Marfavirus属噬菌体THK_07、THQ_07基因组测序完成，揭示其大小169kbp、GC含量40%、含7个tRNA，并通过环境水样（运河、医院废水）分离，证实对38株多重耐药KP宿主菌裂解活性，为噬菌体疗法提供新候选。
摘要
本文报道了在泰国分离出的两种属于Marfavirus属的Klebsiella噬菌体THK_07和THQ_07的完整基因组。THK_07和THQ_07的基因组大小分别为169,304 bp和169,451 bp，GC含量均为40%，并且在这两种噬菌体中均发现了7种tRNA。
公告
Klebsiella pneumoniae（KP）由于能够获得外源性抗菌素耐药基因，已成为日益严重的全球健康威胁，这导致了产生碳青霉烯类耐药性和广谱β-内酰胺酶的菌株的出现（
1–4）。随着经验性抗生素治疗效果的减弱，噬菌体疗法成为一种潜在的替代或辅助抗菌方法。本文描述了来自
Marfavirus属的两种
Klebsiella噬菌体THK_07和THQ_07的基因组。
研究人员使用当地临床分离的KP菌株，对曼谷一条运河中的水样和泰国医院的废水中的噬菌体进行了检测。这两种噬菌体均从KP菌株AMR-0197（BioProject:
PRJNA814829）中分离得到。收集的水样（250 mL）经过离心、过滤（0.45和0.22 μm），然后通过将8 mL滤液与2 mL 5× Heart Infusion Broth（HIB，Becton Dickinson）和50 μL AMR-0197混合进行富集，并在37°C下振荡培养过夜。富集后的滤液通过HIB双层琼脂平板点样法进行滴定。将100 μL AMR-0197与100 μL系列稀释的富集滤液（浓度约为初始滴度的1/100）在SM缓冲液中混合，再将此混合物与0.7% HIB软琼脂混合，最后涂布在1.5% HIB琼脂平板上。挑选出明显的噬菌斑，用SM缓冲液重新悬浮并过滤至少两次或三次，以获得纯化的噬菌体。
噬菌体被扩增至滴度超过1 × 10^10 PFU/mL，随后使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）提取基因组DNA。使用Qubit dsDNA HS（高灵敏度）检测试剂盒（Invitrogen，ThermoFisher Scientific）对DNA进行定量，确保其浓度至少为1,000 ng/μL。文库制备、质量控制和测序工作由BIONICS（首尔，韩国）公司使用Enzymatic Preparation kit（Celemics, Inc.，韩国）和MiSeq v2（300循环）在Illumina MiSeq仪器（Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥）上完成。数据分析使用Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center服务器上的组装服务工具进行（
5）。蛋白质编码序列（CDSs）使用Pharokka v1.7.3和相应数据库v1.4.0进行注释（
6）。PhageTerm和CheckV分别用于分析基因组末端和完整性（
78）。所有软件均使用默认参数。
基因组序列的总结见
表1。基因组分析显示不存在与溶原性相关的基因（
图1A）。这两种基因组被预测为环状排列且末端重复。为了进行分类学鉴定，从NCBI数据库中获取了亲缘关系密切的基因组，并使用VIRIDIC工具分析了基因组间的相似性（
9），结果显示与参考
Marfavirus基因组的基因组相似性超过88%（
图1B）。
表1 THK_07和THQ_07的完整基因组测序结果
|
THK_07 |
THQ_07 |
| 位置（省份） |
曼谷 |
春武里 |
| 样本来源 |
运河水 |
医院废水（预处理水） |
| 原始读段数量 |
101,154 |
108,207 |
| 阳性斑点数量 |
68,537 |
108,207 |
| 完整基因组总长度（bp） |
169,304 |
169,451 |
| 基因组覆盖度（×） |
142.89 |
141.82 |
| CheckV完整性 |
99.21% |
99.05% |
| CheckV质量 |
高质量 |
高质量 |
| GC含量（%） |
40.84% |
40.95% |
| CDS数量 |
303 |
302 |
| 具有预测功能的基因数量 |
134 |
135 |
| tRNA数量 |
7 |
7 |
| 分类学鉴定（属） |
Marfavirus |
Marfavirus |
| GenBank登录号 |
PV963843 |
PV963844 |
| 生物样本 |
SAMN49815975 |
SAMN49815976 |
| SRA登录号 |
SRR34390307 |
SRR34390306 |
图1 THK_07和THQ_07的基因组分析。（A）使用EasyFig版本2.2.2（https://mjsull.github.io/Easyfig/）对THK_07、THQ_07及其亲缘噬菌体的基因组进行了可视化比较分析。功能基因组用不同颜色表示（见图例）。BLASTn结果以灰色条表示，颜色越深表示相似度越高。Klebsiella噬菌体vB_Kpn_F48（GenBank登录号：MG746602）和Klebsiella噬菌体marfa（GenBank登录号：MN044033）的功能蛋白类别来自PHROG数据库（B）。VIRIDIC热图显示了THK_07与亲缘噬菌体Klebsiella marfa和Klebsiella噬菌体vB_Kpn_F48之间的基因组相似性（9）。颜色越深表示基因组间的相似度越高，基因组比对分数（0.9和1.0）也相应显示在下方。
对这些噬菌体在本地分离的多重耐药性KP菌株（38株）上的测试表明，这两种噬菌体分别能够感染额外的29种和26种KP宿主。这些初步结果表明，它们可以作为开发噬菌体联合疗法的候选对象。
致谢
该项目由军事传染病研究计划（MIDRP）（MI240071）资助。
作者感谢泰国春武里的Queen Sirikit Naval Hospital提供的水样。
材料已由Walter Reed陆军研究所审核。对其展示和/或发表没有异议。本文中的观点或声明仅代表作者个人观点，不应被视为陆军部或国防部的官方立场。
