来自11个SARS-CoV-2分离株长期连续传代的全基因组测序数据

《Microbiology Resource Announcements》：Whole-genome sequencing data from long-term serial passaging of 11 SARS-CoV-2 isolates

SARS-CoV-2连续传代研究揭示长期适应性演化机制及基因组稳定性。采用全基因组测序分析11株病毒33-100次体外传代数据，发现病毒在传代过程中未出现衰减现象，并检测到多例驱动宿主细胞进入的新发突变。

　　

摘要

连续传代培养有助于研究病毒在体外环境中的进化轨迹，从而可以与现实世界中人类群体的进化趋势进行比较。我们在此公布了一个2020–2023年的纵向数据集，该数据集包含11株严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）分离株的基于扩增子的全基因组测序结果，这些分离株经历了33至100次的连续传代培养。

公告

我们最近在一项长期连续传代研究中调查了SARS-CoV-2（冠状病毒科：β冠状病毒）的突变积累情况，分析了不同传代系之间的趋同进化现象，并将其与全球临床分离株进行了比较（1）。选择了11株SARS-CoV-2分离株，代表了9个不同的SARS-CoV-2谱系，这些谱系涵盖了2019冠状病毒病（COVID-19）大流行期间的早期（A.2.2）到晚期（奥密克戎：BA.1）阶段，重点关注了世界卫生组织指定的值得关注的变异株和正在研究的变异株。这些分离株来源于澳大利亚新南威尔士州东南部悉尼地区常规诊断测试中采集的鼻咽拭子样本。将拭子在病毒运输培养基中离心过滤后，取100 μL含有病毒的液体用于接种Vero E6细胞（ECACC #85020206），这些细胞培养在含有10%胎牛血清和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺（MEM-10）的Gibco最低必需培养基中，并在37°C、5%二氧化碳条件下培养。每次传代间隔为3–4天，直到观察到细胞病变效应，然后将培养的病毒用于下一次传代，具体细节见参考文献1。每条传代系至少进行了33次连续传代，部分早期传代系（例如B.1.319）进行了更多次传代（共100次）。

我们的全基因组测序策略是（在可能的情况下）首先对原始临床分离株（第0代）以及第1–6代进行测序，之后每隔三代进行一次测序。部分第0代样本是通过Oxford Nanopore Technology的快速方法测序的，但本公告主要关注其余的短读长测序数据，这些数据按照之前的方法生成（1, 2）。简要来说，核酸提取使用的是MagNA Pure 96系统（Roche Diagnostics，德国曼海姆）；RNA提取后使用SuperScript IV VILO Master Mix进行逆转录；cDNA使用“Midnight”协议通过1,200 nt的拼接扩增子进行扩增（3）；扩增子产物使用Illumina DNA Prep Kit进行短读长测序（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）；最后使用Illumina Miseq（试剂盒v.2）进行150 bp的双端测序。所有步骤均按照各自制造商的协议进行。所得到的231组双端测序数据使用内部生物信息学流程进行分析，参数设置为默认值（4），详细过程见参考文献1，测序平均覆盖率为99%以上，平均深度约为1,372倍，每个样本的读数约为279,000个（范围：11,533–731,494个），不同传代系之间的数据一致性较高（图1）。

图1

图1 不同传代系SARS-CoV-2分离株的测序指标总结。小提琴图显示了每个样本的读数分布；黑点/横线表示平均值。(a) 每个样本的目标读取数量（对数10尺度）。(b) 基因组覆盖百分比（≥10%）。(c) 每个样本的平均测序深度（对数10尺度）。注意：这些统计数据排除了RCoV0206传代系中一个测序质量较差的异常样本（SRA访问号：SRR26083382）。所有指标均使用内部生物信息学流程的默认参数进行估算（4），低质量测序读数和残留的测序接头使用fastp v.0.23.2去除（5），使用bwa mem v.0.7.17-r1188将读数映射到SARS-CoV-2参考基因组（NC_045512.2：29903 nt，约38% GC）（6），使用ivar v.1.3.1对扩增子引物区域进行软剪切（7），并使用bedtools v.2.30.0估计基因组覆盖率（8）。x轴上的标签代表内部标识符，与上传到国家生物技术信息中心序列读取档案（PRJNA1018257）的测序数据集的标识符相对应。

纵向追踪这些数据中的突变轨迹可以揭示病原体进化的重要信息以及更广泛的进化机制，如趋同进化、适应性和遗传漂变（1）。例如，许多在连续传代过程中新出现的突变已知会驱动细胞进入机制的变化（9），尤其是在Vero E6细胞中（10），并且与临床显著现象相关，如治疗效果的改变（11）。此外，我们证明SARS-CoV-2可以连续传代多达100次而不会出现明显的适应性下降或减弱（1）。我们预计这些测序数据将对研究SARS-CoV-2进化及一般实验进化的微生物学界具有重要意义。

致谢

作者衷心感谢所有协助完成这项工作的合作者，包括提供合适的临床分离株和/或核心实验室基础设施的学者，如Stuart Hamilton博士、Zin Naing博士、Anna Condylios女士、Stuart Turville副教授以及Anthony Kelleher教授。