Mei5-Sae3通过不依赖ATP水解的机制稳定Dmc1活性与失活态 filaments

《Nucleic Acids Research》：Mei5–Sae3 stabilizes both active and inactive forms of Dmc1 filaments independently of its impact on ATP hydrolysis

本研究针对减数分裂重组中Dmc1 recombinase的调控机制，揭示了其辅助因子Mei5-Sae3通过桥连protomer稳定Dmc1 nucleoprotein filaments的新机制。研究发现Mei5-Sae3不仅能稳定ATP结合的活性态filament（pitch~10 nm），还能在ADP存在下稳定失活态filament（pitch~8 nm），且该作用独立于其对ATP水解的促进作用。通过D-loop assay、电子显微镜和荧光偏振等技术，证实Dmc1-E157D突变体虽丧失ATPase活性但仍能介导重组，表明Dmc1的homology search和strand exchange功能不依赖ATP水解。该发现为理解真核生物同源重组调控提供了新视角，对生殖细胞基因组稳定性研究具有重要意义。

　　

在生命演化的长河中，减数分裂如同精密的分子舞蹈，确保遗传信息在世代间准确传递。这一过程的核心——同源重组，依赖RecA家族蛋白Dmc1在DNA断裂处形成螺旋状核酸蛋白丝，执行同源搜索和链交换任务。然而，真核生物Dmc1的活性严格受控于辅助因子Mei5-Sae3，其作用机制如同尚未解开的密码，尤其在与ATP水解循环的关联上存在争议。传统观点认为，高浓度钙离子（Ca²⁺）或非水解型ATP类似物AMP-PNP可通过抑制ATPase稳定Dmc1活性态，但生理条件下Mei5-Sae3如何协调这一过程仍不明确。

为破解这一谜题，芝加哥大学Douglas K. Bishop团队在《Nucleic Acids Research》发表研究，通过多学科技术手段揭示Mei5-Sae3能以不依赖ATP水解的方式直接桥连Dmc1 protomer，同时稳定其活性与失活态filament。这一发现革新了对真核重组酶调控的认知。

研究团队运用D-loop assay定量链交换效率，荧光偏振技术分析蛋白-DNA结合亲和力，电子显微镜观察filament形态与长度，薄层色谱法检测ATP水解动力学，并辅以滤膜结合实验和核苷酸释放测定。所有实验均以酵母Sacchromyces cerevisiae来源的重组蛋白为材料，在接近生理条件（70 μM Ca²⁺、5 mM Mg²⁺）下进行。

Mei5-Sae3在生理钙离子浓度下增强Dmc1活性

通过系统调节Ca²⁺浓度，发现当Ca²⁺从非生理水平的250 μM降至生理浓度70 μM时，Mei5-Sae3对Dmc1介导的D-loop形成促进作用从1.2倍提升至2.5倍。

这表明高Ca²⁺可能掩盖了Mei5-Sae3的生理功能。值得注意的是，能绕过Mei5-Sae3需求的突变体Dmc1-E157D虽在体内具备重组能力，但其体外活性严重依赖高钙环境，且存在温度敏感性和ATP结合缺陷，提示其调控机制与野生型存在本质差异。

Mei5-Sae3通过核苷酸依赖方式增强DNA结合

荧光偏振实验显示，Mei5-Sae3能使Dmc1与ssDNA的表观解离常数（K_D）在ATP、ADP和AMP-PNP存在下分别降低2.0倍、1.5倍和1.5倍，但在无核苷酸时无效。

该效应具有物种特异性，对E. coli RecA无效。尤为关键的是，Mei5-Sae3对Dmc1-E157D的DNA结合无促进作用，进一步佐证二者作用机制的差异性。

电子显微镜揭示filament构象稳定机制

负染电镜显示，在70 μM Ca²⁺和ATP条件下，Dmc1 filament仅17%为伸展活性态（pitch~10 nm），而加入Mei5-Sae3后活性态比例升至76%，平均长度从66 nm增至96 nm。

更令人惊讶的是，在ADP存在时（全部为压缩失活态），Mei5-Sae3仍使filament长度增加2.3倍（64 nm→158 nm）。Dmc1-E157D自身即能以75%比例形成活性态filament，且不受Mei5-Sae3影响。这些结果首次证明Mei5-Sae3的filament稳定功能不依赖于核苷酸水解状态。

ATP水解加速与核苷酸循环调控

薄层色谱分析表明，Mei5-Sae3使Dmc1的ATP水解率提高2倍，而Dmc1-E157D完全丧失ATPase活性。

滤膜结合实验发现Mei5-Sae3不改变Dmc1的ATP结合亲和力，但能促进ADP释放（35%核苷酸被置换），而对AMP-PNP无此效应。

filament内核苷酸分析显示，稳态下ATP/ADP比例为1.8，加入Mei5-Sae3后ATP占比略降，符合其促进水解循环的特性。

研究最终通过AlphaFold3建模提出分子机制模型：Mei5-Sae3异源二聚体可桥连5个连续Dmc1 protomer，其螺旋结构域部分遮蔽第二链DNA结合位点，这或许解释了其在体内特异性促进ssDNA而非dsDNA结合的功能。

本研究突破性地证实Mei5-Sae3通过原体桥连稳定Dmc1 filament的机制独立于ATP水解循环，而ATP水解加速可能是活性态稳定的结果而非原因。Dmc1-E157D突变体的成功功能验证表明，减数分裂重组根本不需要Dmc1的ATP水解活性。这一发现不仅统一了真核与原核重组酶的功能演化框架，更对理解生殖细胞基因组稳定性调控及相关疾病机制具有深远意义。