综述：自1995年以来产气荚膜梭菌研究的里程碑

《Anaerobe》：Milestones in Clostridium perfringens Research Since 1995

破伤风梭菌作为人畜共患病原体，其致病机制与毒素多样性研究自1995年后取得显著进展。基因组测序揭示其携带30余种毒素基因，其中CPA、PFO等传统毒素的致病性通过分子Koch法则得以验证，新毒素如NetB通过毒理学研究确认其与禽类坏死性肠炎的因果关系。移动遗传元件如接合性质粒通过携带多种毒素基因（如CPB、ETX）和抗生素耐药基因（如tet）实现快速传播，其中Tcp质粒家族的35 kb保守区域编码共轭转移所需的IV型分泌系统。调控网络涉及VirS/VirR双组分系统、Agr-like QSS（通过AIP调控毒素合成）及环境感应系统（如EutV/EutW调控乙醇胺响应）。芽孢形成机制研究显示SASP-4蛋白增强芽孢热稳定性，使其在食物链中存活，并通过SleC蛋白水解作用完成萌发。当前研究仍需解决毒素协同作用、肠道特异性孢子形成触发机制等问题。

　　近年来，科学家们对一种名为“产气荚膜梭菌”（Clostridium perfringens）的细菌进行了大量研究，这种细菌在人类和兽医领域都具有重要的病原体作用，同时也是一种常见的肠道正常菌群成员。从1995年至今，随着分子生物学技术的发展，人们对这种革兰氏阳性、厌氧、能形成芽孢的细菌的致病性和生物学特性有了显著的进展。例如，现在对它的“传统”毒素（如CPA、PFO、ETX、CPB、ITX和CPE）的结构和作用有了更深入的理解，许多毒素的致病重要性也得到了明确的验证。此外，自1995年以来，还发现了几种新的毒素，其中至少有一种（NetB）已被明确与疾病相关联。移动遗传元件，特别是共轭质粒，在致病性和抗生素耐药性中的重要性和多样性已得到确立。多个调控毒力基因表达的调节因子已被识别，并且在某些情况下，其调控机制也得到了阐明。对于某些调节因子，其在毒力中的重要性也得到了验证。此外，对这种细菌的芽孢形成和萌发机制的理解也有所提高，以及芽孢在疾病传播和致病过程中的作用。尽管取得了这些进展，但仍有一些重要的问题有待进一步研究。

产气荚膜梭菌的致病性在很大程度上涉及其超过20种毒素的庞大武器库。然而，不同菌株之间的毒素生产存在差异。这种差异在毒素类型分类方案中得到了利用，该方案使用多重PCR技术将产气荚膜梭菌菌株分为七种类型（A-G），根据其是否携带六种毒素基因。例如，已知产气荚膜梭菌类型F的食物中毒是由携带CPE基因的菌株引起的，而气性坏疽通常由类型A菌株引起。这种分类方法为理解不同菌株的致病性提供了重要依据。

在2002年，Shimizu实验室完成了产气荚膜梭菌类型A菌株13的完整基因组测序，这是在当时的技术条件下一项艰巨的任务。这一成就标志着第一个革兰氏阳性病原性厌氧菌的基因组测序完成，并为研究该细菌的基因组和毒素基因提供了新的见解。例如，产气荚膜梭菌缺乏某些氨基酸的合成基因，其基因组大小约为3.5 Mb。随后，在2006年，Myers等人的研究进一步完成了两种产气荚膜梭菌菌株的基因组测序，其中包括SM101，这是一种可转化的类型F食物中毒菌株，其染色体携带CPE基因，并且常用于类型F食物中毒菌株的研究。随着新一代测序技术的广泛应用，现在已有数百种产气荚膜梭菌基因组可供研究（例如文献12和13），这些数据与多基因位点序列分型（MLST）的结果相结合，揭示了产气荚膜梭菌具有相对多样的泛基因组，包括4-5个不同的类群。其中，携带CPE基因的类型F菌株及其相关菌株属于一个单一的类群，这有助于解释它们独特的表型特征，例如它们产生的芽孢具有极强的耐热性和耐冷性，能够抵抗其他环境压力。

基因组测序还表明，CPA和PFO都是染色体编码的毒素。然而，一系列脉冲场凝胶南方杂交方法（主要在1995年至2010年代进行）将该细菌的大多数其他毒素基因定位在质粒上。CPA和PFO的编码基因位于染色体上，而其他毒素基因如CPB、ETX、ITX或NetB的编码基因则位于质粒上。有趣的是，CPE基因既可以是染色体编码的，也可以是质粒编码的。产气荚膜梭菌的毒素质粒通常较大，可以达到135 kb以上。此外，一个产气荚膜梭菌菌株可以携带多个毒素质粒，而单个质粒可以携带多达四个不同的毒素基因。

在2006年，Miyamoto等人和Bannum等人分别对两种类型F菌株（F4969和F5603）的CPE质粒和pCW3质粒进行了独立测序。这项工作揭示了这三个质粒共享约35 kb的保守区域，但还包含不同的可变区域，这些区域编码其他基因，如β2毒素（CPB2）、细菌素（对于F4969）或四环素耐药性（对于pCW3）。后续的测序和重叠PCR研究显示，大多数其他类型F菌株的CPE质粒与F4969或F5603的CPE质粒相似。此外，携带β毒素（cpb）、ε毒素（etx）、ι毒素（itx）或Necrotic Enteritis B-like毒素（netB）基因的质粒也含有类似的保守区域。这些质粒通过共轭转移，可以高频率地转移到其他产气荚膜梭菌菌株中，这一特性最早在1970年代被发现用于抗生素耐药性质粒的转移。2001年，Brynestad等人首次展示了CPE质粒的共轭转移能力，这为产气荚膜梭菌的毒素质粒研究奠定了基础。

近年来，另一个名为Pcp质粒的产气荚膜梭菌质粒家族被发现。这些质粒可以很大（超过100 kb），并且一些携带编码二元梭菌肠毒素（BEC）或β2毒素（cpb2）的基因，即β2毒素（也被称为CPB2）。此外，Pcp质粒使用与Tcp质粒不同的共轭转移系统，即与Tcp质粒不同的IV型分泌系统。还有一组非共轭质粒，它们与细菌素质粒pIP404相关。最近，非共轭携带CPE基因的质粒也被发现，进一步增加了产气荚膜梭菌毒素质粒的多样性。此外，Bcp家族质粒也出现在产气荚膜梭菌中，它们似乎具有一个新颖的共轭位点，尽管共轭转移尚未被证实。

除了毒素质粒，产气荚膜梭菌还具有调控毒素生产的其他调节因子，如VirS/VirR二组分调控系统（TCRS）和类似Agr的群体感应系统（QSS）。这些调节因子在毒力基因的表达调控中发挥重要作用，但它们的研究相对较少。例如，产气荚膜梭菌的基因组编码了超过20个TCRS，其中至少两个（RevS/RevR和EutV/EutW）对毒力至关重要。RevS/RevR调控多种降解酶的表达，如clostripain和sialidases。RevR在小鼠模型中对气性坏疽的发展具有重要意义。在EutW/EutV TCRS中，EutW感知宿主细胞中的乙醇胺，并激活EutV转录调节因子。这种激活与VirS/VirR和类似Agr的QSS协同作用，导致产气荚膜梭菌的增强生长、毒素的增加生产以及在小鼠气性坏疽模型中的毒力。

类似地，产气荚膜梭菌还具有另一个QSS，即自诱导剂-2（AI-2）QSS。该QSS可能对毒力具有重要意义，因为它调控CPA和PFO的生产。然而，在类型C菌株CN3685中，AI-2 QSS的失活并未影响肠道毒力。这些发现表明，尽管AI-2 QSS可能在某些情况下参与调控毒素生产，但其对产气荚膜梭菌毒力的贡献尚不明确。

除了上述调控因子，产气荚膜梭菌的毒力基因表达还有其他调节因子被发现，如CodY和CcpA。CodY是一种在革兰氏阳性细菌中起重要作用的全局转录调节因子。在类型D菌株CN3718中，CodY结合到etx启动子上并正向调控etx表达，尽管它不影响该菌株的pfoA或cpa表达。然而，CodY在CN3718中会减少芽孢形成，但在类型F菌株SM101中则会增加芽孢形成和CPE生产。CcpA（碳水化合物控制蛋白）是另一种全局调节因子，属于LacI/GalR家族。在葡萄糖浓度增加的情况下，CcpA会抑制许多基因的表达，但也正向调控ETX和CPE的生产，以及产气荚膜梭菌的芽孢形成。有趣的是，CodY、CcpA和NanI sialidase在类型D菌株CN3718中相互作用，以增强ETX的生产。此外，NanR和virX RNA等其他调节因子也将在后续讨论中提及。

产气荚膜梭菌的毒素可以分为两大类，即酶类毒素和形成孔的毒素。自1995年以来，对这些毒素的结构、受体识别、分子作用机制及其在疾病中的作用有了显著的进展。以下是对这些毒素的简要比较，以及当前对它们的理解。首先，酶类毒素，如CPA、ITX、BEC和TpeL，它们的分子量、LD50值、主要疾病和受体等特性在表格2中进行了总结。

CPA是一种43 kDa的单链多肽，具有细胞毒性、溶血性和致死性。它是一种依赖锌的金属蛋白酶，由两个结构域组成。第一个结构域（残基1-246）富含α螺旋，与其它细菌的磷脂酶C酶有部分同源性。第二个结构域（残基256-370）富含β折叠，是膜结合的。CPA通过其催化位点同时具有磷脂酶C和鞘氨醇酶活性。这种毒素对宿主细胞有复杂的效应，这些效应受到毒素剂量、宿主种类和细胞类型的影响。在某些宿主的红细胞中，CPA通过增加神经酰胺和鞘氨醇1-磷酸的水平促进溶血，但同时也与GTP结合蛋白相互作用，激活宿主的磷脂酶，产生类似的终产物。在中性粒细胞中，CPA结合到GM1，并与神经生长因子酪氨酸激酶受体1（TrkA）相互作用，激活磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1，同时与GTP结合蛋白相互作用，激活内源性磷脂酶C，生成二酰甘油。这些效应触发信号转导变化，导致O2-的产生，进而引发细胞凋亡或IL-8的释放。

ITX是一种二元毒素，由Ia（酶组分）和Ib（结合组分）组成，分别由iap和iab基因编码。Ib最初被合成为一个100 kDa的不活跃蛋白，但通过胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（或可能的产气荚膜梭菌λ毒素）的蛋白水解激活。这些蛋白酶也切割Ia前体的N末端9-13个氨基酸，从而激活ITX组分。ITX的作用开始于激活的Ib与其受体（脂解刺激脂蛋白，也称为anguillin-1）结合。结合的Ib随后形成七聚体前孔，这些前孔本身具有孔和某些细胞毒性作用。然而，当Ia与Ib七聚体结合时，会触发内吞作用和Ia进入细胞质，从而形成经典ITX。Ia将ADP-核糖结合到肌动蛋白的Arg177残基上，导致肌动蛋白丝解聚，进而导致细胞骨架塌陷，可能引发caspase-3激活和细胞凋亡。

BEC是另一种产气荚膜梭菌的二元毒素，由BECa（酶组分）和BECb（结合组分）组成。这些蛋白与ITX的Ia和Ib具有约40-45%的序列同源性。BEC的受体尚未明确，但其在细胞水平上具有与ITX相似的ADP-核糖化肌动蛋白的能力。该毒素在哺乳动物中具有肠毒性，特别是在哺乳动物中，BEC产生菌株的肠毒性显著。然而，BECb突变株的毒力被减弱，因此，该毒素的毒力贡献尚未完全证实。

TpeL是一种约205 kDa的单链多肽，属于大梭菌糖基化毒素（LGT）家族，包括如梭菌样肠毒素A和B。TpeL含有N末端糖基转移酶结构域（GTD）、半胱氨酸蛋白酶结构域（CPD）和转运及受体结合结构域（T）。然而，与其它LGT毒素不同，TpeL缺乏C末端的CROPS（组合重复寡肽）结构域。TpeL的受体是脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）。TpeL通过T结构域与LRP1结合，并通过内吞作用进入细胞。CPD结构域释放GTD结构域，该结构域进入细胞质，对Ras蛋白进行N-乙酰葡糖胺化，发生在Threonine 35上。这种修饰使Ras失活，并引发多种效应，包括细胞凋亡。

自1995年以来，对产气荚膜梭菌的形成孔毒素有了显著的进展。这些毒素包括胆固醇依赖性细胞溶解毒素（CDC）、两种气溶菌家族毒素和几种与金黄色葡萄球菌α溶血素家族相关的毒素。PFO是形成孔毒素的典型代表，主要因其结构和功能的初步研究而闻名。PFO是一种约55 kDa的单链多肽，属于CDC形成孔毒素。PFO是第一个被解析结构的产气荚膜梭菌毒素，其结构揭示了该毒素的四结构域（D1-4）的组成，其中D1、D2和D4结构域排列在富含β折叠的线性结构中，而D3结构域由β折叠和两个α螺旋束组成。PFO的作用开始于它通过D4结构域与胆固醇结合，随后在膜表面形成前孔。每个PFO前孔中的两个α螺旋束重新折叠成β发夹结构，刺穿膜，形成β桶状孔。这些孔由多达50个单体组成，直径可达150-300埃。PFO的主要已知致病作用是与CPA协同作用，导致类型A菌株引起的气性坏疽。有趣的是，PFO对于类型F食物中毒并非必需，因为许多类型F食物中毒菌株天然缺乏pfoA基因。同样，在类型C肠炎中，pfoA基因的缺失突变株仍具有完整的毒力。

CPE是一种35 kDa的单链多肽，具有独特的氨基酸序列，但属于气溶菌家族成员。CPE由N末端结构域（残基1-197）和C末端结构域（残基198-319）组成。C末端结构域负责受体结合，而N末端结构域负责寡聚化和孔形成。一旦在肠道中产生，CPE会迅速被肠道蛋白酶（如胰蛋白酶）处理，但处理后的毒素仍具有体内和体外的毒性。CPE与某些claudin家族的紧密连接蛋白结合，形成一个约90 kDa的复合物，该复合物可能包含非受体claudin，如claudin-1。大约六个这样的小复合物寡聚化形成一个约450-500 kDa的前孔。每个CPE在前孔中的N末端结构域的α螺旋（残基80-110）展开成β发夹环，所有六个β发夹环相互作用形成β桶状孔。该孔直径约为1.4纳米，具有阳离子选择性，导致Ca2+的流入。低剂量的CPE形成少量孔，导致有限的Ca2+流入，引发适度的钙蛋白酶激活，进而引发经典的caspase-3介导的细胞凋亡。高剂量的CPE形成大量孔，导致强烈的Ca2+流入，引发钙蛋白酶激活和坏死性凋亡。

类型F菌株是人类肠道病原体，引起常见的类型F食物中毒和3-15%的抗生素相关性腹泻（AAD）病例。CPE的生产在肠道中是类型F菌株致病性的必要条件。CPE的细胞毒性引发肠道损伤，包括上皮细胞剥落和绒毛萎缩。有趣的是，在小肠中，CPE主要结合到受体丰富的绒毛尖端，但会对整个绒毛造成损伤。这可能涉及旁观者效应，即CPE敏感的肠道细胞释放因子，杀死CPE不敏感的肠道细胞。此外，CPE也可能影响结肠，导致肠道损伤，这可能是引发动物模型中肠道液体运输变化（如腹泻）的必要条件。对于因药物引起的便秘副作用的人群，类型F感染可能致命。在小鼠中，CPE的吸收可能涉及肠道腔内的吸收，导致致命的高钾血症。

ETX是一种由类型B和D菌株产生的蛋白，最初被合成为一个近不活跃的33 kDa（296个氨基酸）前毒素。通过使用成年山羊（ETX介导疾病的一个天然宿主）的肠道内容物和特定蛋白酶抑制剂，Freedman等人发现前毒素的处理是由肠道中的丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）启动的，随后由羧肽酶切割。这种蛋白酶处理生成三种不同的约27 kDa ETX变体，每种变体具有不同的C末端氨基酸，但都具有细胞毒性。最近的案例报告显示，山羊羔羊可能对类型D肠毒素中毒具有易感性，这可能与类型D菌株产生大量λ毒素有关。然而，并非所有携带λ毒素基因的类型D菌株都能在体外激活ETX，且一个λ毒素基因缺失的产气荚膜梭菌菌株被发现能够激活ETX。因此，需要进一步研究ETX激活在羔羊中是否涉及类型D菌株的大量λ毒素生产，或是否涉及其他细菌或肠道蛋白酶。

尽管ETX与CPE没有氨基酸序列同源性，但它也是气溶菌毒素家族的成员。ETX富含β折叠，并由三个结构域组成。结构域I是受体结合结构域，而结构域II和III是毒素的孔形成部分。值得注意的是，结构域II具有一个疏水环，插入到膜中形成β桶状孔。ETX的作用开始于它与受体（在培养细胞和小鼠中为髓鞘和淋巴细胞蛋白（MAL蛋白））结合。结合的ETX单体随后形成七聚体前孔，然后进行活性孔的形成。这种孔在最窄处直径为1.2纳米，导致K+流失和ATP耗竭，从而引发坏死。在疾病过程中，ETX在肠道中被产生，然后通过破坏紧密连接和增加肠道通透性促进其自身吸收进入循环。类型D菌株是山羊、绵羊和其他物种肠毒素中毒的主要原因。分子 Koch 假设分析表明，ETX在自然宿主（山羊和绵羊）和实验室动物模型（小鼠）中对类型D菌株的毒力具有关键作用。有趣的是，类型D感染在不同自然宿主中的表现有所不同。在山羊中，类型D感染主要涉及胃肠道疾病，尽管有时会伴随全身变化。然而，在绵羊中，类型D疾病主要涉及全身效应，如脑和肺水肿和心包积液，胃肠道效应有限。

关于小鼠的静脉LD50，ETX是第三强的梭菌毒素，仅次于肉毒毒素和破伤风毒素。ETX比其他形成孔毒素更强大的原因之一是它能结合脑血管的内皮细胞，然后破坏血脑屏障。一旦进入脑实质，该毒素会引起髓鞘破坏和神经细胞坏死。有趣的是，一些研究表明ETX可能引发人类的多发性硬化症，但这一观点存在争议。

CPB是一种35 kDa的单链多肽，属于金黄色葡萄球菌α溶血素家族的形成孔毒素。CPB对蛋白酶非常敏感，尤其是胰蛋白酶，因此它仅在具有低胰蛋白酶水平的宿主中活跃，如由于年龄、营养不良或饮食中富含胰蛋白酶抑制剂的宿主。CD31（PECAM-1）已被确定为CPB的内皮细胞受体。尽管CPB可能通过某种机制穿透肠道上皮，进入内皮细胞，但其具体机制尚不清楚。一旦结合到CD31，CPB会寡聚化（推测为八聚体）并形成孔，导致Ca2+进入细胞，激活钙蛋白酶。这种效应会导致可被Necrostatin抑制的细胞死亡，可能涉及坏死性凋亡或细胞凋亡。CPB由类型B和C菌株产生。类型B菌株与山羊的致命性出血性肠炎相关，而类型C菌株则导致反刍动物和马的肠炎或肠毒素中毒。类型C菌株还与一种罕见的人类食物中毒疾病有关，称为肠炎坏死性（或PigBel），这种疾病发生在肠道胰蛋白酶水平较低的人群中，如由于饮食、营养不良或疾病。分子 Koch 假设分析表明，CPB在类型C菌株的致病性中起重要作用。此外，纯化的CPB足以在动物模型中引发肠炎或肠毒素中毒。然而，在低毒素浓度下，CPB和CPE可以协同作用，引发肠道损伤。

NetB是一种33 kDa的单链多肽，是金黄色葡萄球菌α溶血素家族的另一个形成孔毒素成员。NetB与CPB具有38%的序列同源性，包括一些关键的参与孔形成的残基。NetB孔是七聚体，估计直径为1.7纳米。这种孔允许离子流入，可能导致渗透性裂解。禽类坏死性肠炎是一种重要的农业问题，每年造成数十亿美元的损失。这种疾病涉及小肠黏膜中坏死性病变的形成。临床形式通常发生在幼鸟中，表现为腹泻、进食减少和数小时内死亡。亚临床形式影响所有年龄的鸟类，表现为形成宏观肠道病变；这种形式常影响生产性能，如饲料转化率降低。最初认为这种疾病是由CPA介导的，但分子 Koch 假设分析表明，NetB是主要的毒素。尽管有大量证据表明NetB是类型G菌株在禽类坏死性肠炎中的主要毒力因子，但也有报告称某些鸡的这种疾病中无法分离出NetB菌株。这可能是由于netB质粒的不稳定性或其他原因，需要进一步研究。

产气荚膜梭菌还产生其他与CPB、NetB和其他梭菌α毒素家族毒素相关的形成孔毒素，包括NetF、NetE、NetG和δ毒素。δ毒素由某些类型B和C菌株产生，其结构与NetB相似。GM2神经节苷脂已被提出为它的受体。这种毒素对多种细胞培养系具有细胞毒性，形成约4纳米的中等大小的孔。这种孔导致ATP耗竭和肿胀，进而引发坏死。δ毒素还影响人类肠上皮样Caco2细胞的屏障功能。在小鼠肠道中，它导致组织学损伤、绒毛缩短和肠上皮细胞脱落，可能是通过ADAM10介导的黏附连接中cadherin的降解。这种毒素在疾病中的作用仍有待定义。

产气荚膜梭菌的毒力还涉及多种降解酶，如蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和唾液酸酶。这些酶的描述作为降解酶还是毒素并不总是明确的，例如λ毒素是一种蛋白酶，可以在体外激活ETX和ITX，但纯化的λ毒素在静脉注射时也会导致出血性水肿。除了λ毒素，产气荚膜梭菌还产生其他蛋白酶，如clostripain（一种强效内蛋白酶）和胶原酶。这些蛋白酶在小鼠的气性坏疽模型中并非导致产气荚膜梭菌致病性的必要条件。此外，有证据表明唾液酸酶可能对类型F肠炎的毒力有贡献。通过使用nanI突变株，研究显示NanI增强F4969（一种携带CPE基因的类型F食物中毒菌株）的生长，特别是在存在黏液的情况下，并增加其对肠上皮样细胞的附着。这种唾液酸酶还增加该菌株在小鼠小肠环模型中的生长和定植。此外，NanH、NanI和NanJ各自增加CPE对Caco-2细胞的结合和细胞毒性。在肠道中，NanI还增加CPE引起的肠道损伤。NanI还增强CPB、ETX和NetB的体外细胞毒性。

产气荚膜梭菌可以利用唾液酸酶将唾液酸从糖蛋白中裂解，然后通过转运蛋白和酶编码的nan操纵子内部化和代谢这种释放的唾液酸。大多数产气荚膜梭菌菌株都会产生这三种唾液酸酶，但NanI是主要的唾液酸酶活性来源。有趣的是，携带染色体cpe基因的类型F菌株和一些相关的人类疾病菌株通常缺乏nanI基因。这些类型F染色体cpe菌株在芽孢形成过程中产生NanH，并且当母细胞裂解时，这种唾液酸酶与CPE一起被释放。这种释放可能与产气荚膜梭菌的芽孢形成和释放过程有关。

产气荚膜梭菌的芽孢形成和萌发机制的研究也取得了显著进展。大多数产气荚膜梭菌菌株可以形成芽孢，这种能力对其致病性至关重要。芽孢对于产气荚膜梭菌的传播至关重要，它们可以污染伤口，进而引发气性坏疽，或被摄入后引发AAD。芽孢的萌发对于产气荚膜梭菌的致病性也具有重要意义，例如，当类型F菌株在肠道中形成芽孢时，它们需要萌发以产生CPE。芽孢的形成和萌发机制的深入研究有助于理解产气荚膜梭菌在不同环境下的生存和传播能力。

芽孢萌发的过程开始于产气荚膜梭菌感知到小分子，称为萌发因子，这些因子因菌株而异，包括KCl、氨基酸和磷酸盐。这些萌发因子结合到芽孢表面的受体上，其中类型F食物中毒菌株的受体主要是GerKC。萌发因子的结合诱导CspB介导的蛋白酶激活SleC。SleC是一种角质层水解酶，它去除芽孢的角质层，允许芽孢核心的水合，从而恢复代谢。芽孢萌发还涉及钙二氨基磷酸盐从芽孢核心的移除和与芽孢DNA结合的SASP的移除，以恢复转录。

产气荚膜梭菌的抗生素耐药性也引起了广泛关注。多项调查显示，产气荚膜梭菌的抗生素耐药性呈上升趋势，有时包括多重耐药。一个可能的解释是，四环素耐药质粒pCW3具有共轭转移能力，有助于四环素耐药性的传播。其他耐药性元件，如氯霉素、杆菌肽和林可酰胺的耐药性基因，也与与pCW3相关的共轭质粒有关。尽管TetP耐药性基因不位于可转座元件上，但其他耐药性决定因子可能位于这些元件上，例如氯霉素耐药性决定因子与可移动遗传元件Tn4451有关。这种情况与产气荚膜梭菌毒素基因的携带方式相似，许多毒素基因与移动遗传元件插入到共轭质粒上有关。

尽管在产气荚膜梭菌的研究中取得了许多进展，但仍有许多问题有待解决。例如，哪些新发现的产气荚膜梭菌毒素对疾病至关重要？还有哪些毒素尚未被发现？除了CPA和PFO，或者CPB和CPE，是否有其他毒素可以协同作用？什么触发了产气荚膜梭菌的肠道芽孢形成？这些问题的答案将有助于进一步理解产气荚膜梭菌的致病机制，并为未来的研究提供方向。科学家们对这些问题的答案充满期待，并希望它们能够推动对产气荚膜梭菌致病性的更深入研究。