有机施肥能够提高土壤质量，并在半干旱地区的黄芪（Astragalus）农业生态系统中稳定功能性真菌网络

《Applied Soil Ecology》：Organic fertilization enhances soil quality and stabilizes functional fungal networks in semi-arid Astragalus agroecosystems

土壤真菌对有机肥的响应及其对土壤质量的影响。研究显示，粪肥（MF）和堆肥（CF）显著提高土壤质量指数（SQI）和黄芪根系生物量，促进分解者真菌（如Ascomycota和Basidiomycota），抑制病原菌。深度影响真菌组成，表层以共生菌为主，深层以分解菌和病原菌为主。有机肥通过增强土壤有机碳（SOC）、硝酸盐（NO3?-N）和磷（AP）等指标，形成稳定的真菌网络结构，提升系统抗逆性。结论是有机肥替代化肥可改善半干旱区土壤健康和可持续农业。

　　土壤真菌在营养循环和可持续农业中扮演着关键角色，然而它们在半干旱地区*Astragalus*系统中对有机改良措施的响应尚不明确。本研究通过两年的田间实验，分析了粪肥（MF）和堆肥（CF）对土壤性质和真菌群落的影响，采集了36个土壤样本，分别来自0–20厘米和20–50厘米两个深度。通过高通量ITS测序评估真菌群落，并结合网络分析、冗余分析（RDA）、多元线性回归和随机森林模型探讨其与土壤性质的关系。结果表明，MF和CF显著（p < 0.05）提高了土壤质量指数（SQI），从对照（CK）的0.18提升至CF的0.50和MF的0.55。土壤特性和真菌丰度随深度增加而减少，表层土壤更有利于共生型真菌，而深层土壤则更偏向分解型和病原型真菌。有机改良措施显著增加了分解型真菌的丰度（MF: 87.26%；CF: 52.37%），相比CK（47.03%）降低了病原型真菌的比例（MF: 9.43% vs. CK: 29.38%）。Ascomycota和Basidiomycota与SOC、NO??-N和AP呈正相关，突显了它们在营养循环中的作用。网络分析揭示了MF（0.609）和CF（0.625）相比CK（0.555）具有更高的模块性，表明真菌关联性更强，微生物抗逆性更高。这些结果表明，粪肥和堆肥不仅改善了土壤质量和真菌网络的复杂性，还使真菌功能群向分解者转变。这些发现表明，在半干旱农业系统中，使用有机改良措施而非化学肥料可以提高土壤质量并支持可持续农业。

随着全球人口增长和气候变化，土地资源正面临巨大压力，特别是在半干旱地区。这些地区由于蒸发量高、降雨不规律和土壤质量差，更容易受到土地退化的威胁。半干旱地区的土壤通常结构不良、有机质和养分含量低，导致土壤肥力下降、生物多样性减少和作物产量降低。为了应对这些问题，开发可持续的土壤管理实践对于维持生产力和生态系统韧性至关重要。土壤质量，作为其支持生产力、环境质量和健康的能力，是可持续农业生态系统的重要指标。尽管“土壤健康”和“土壤质量”常被混用，但土壤健康强调土壤作为一个生命系统的活力。土壤质量指数（SQI）被广泛用于评估土壤退化、质量和健康状况，尤其是在半干旱地区的土壤管理中具有重要应用价值。

有机改良措施，如粪肥和堆肥，为矿物肥料提供了一种可持续的替代方案。它们通过改善土壤物理化学条件和微生物群落来提高土壤结构、增加有机碳含量、增强水分保持能力，并通过微生物分解提供养分。有机输入不仅改变了真菌群落，还通过促进分解型真菌的丰度，增强了营养循环并有助于抑制病原体。此外，这些改良措施支持了复杂且稳定的真菌网络，通过改善土壤-微生物相互作用和功能冗余，增强了土壤的韧性。土壤真菌作为土壤健康的关键指标，因其在营养循环、碳动态、土壤结构和减少植物胁迫中的重要作用而备受关注。真菌群落在土壤剖面中分布不均，其丰度和多样性通常随深度增加而减少，主要是由于营养和氧气的减少。深层土壤仍可容纳适应特定物理化学条件的特殊真菌群落。

然而，关于有机施肥如何影响半干旱*Astragalus*生态系统中真菌响应的研究仍然有限。*Astragalus membranaceus*是一种具有重要药用和商业价值的多年生豆科植物，其药理活性与多糖、皂苷和黄酮类物质密切相关，而这些物质又受到土壤条件和管理实践的影响。尽管*A. membranaceus*具有较强的适应性，但随着全球对药用作物需求的增加，有机施肥对土壤健康和与该作物相关的真菌群落的影响仍需进一步研究。此前对不同*Astragalus*物种的研究显示了对土壤功能的积极影响，但关于*A. membranaceus*对真菌群落动态和土壤健康的具体影响仍不清楚。目前对土壤真菌群落的研究主要集中在表层土壤，通常忽略了时间变化和深度相关的差异。

为了填补这一知识空白，我们开展了为期两年的田间研究，评估了有机施肥对土壤-真菌动态的多尺度影响。具体来说，我们旨在（i）评估有机施肥对土壤真菌多样性、组成和共现网络的影响；（ii）评估土壤特性变化；（iii）分析真菌群落与土壤性质之间的相互作用；（iv）探讨真菌功能群和土壤特性的空间和时间动态。基于有机改良措施能够丰富分解型真菌并改善土壤功能的证据，我们假设有机施肥会通过增强土壤养分状况提高植物产量和土壤质量，并促进以分解者为主的真菌功能群，从而改善氮和碳循环以及真菌网络的稳定性。我们的研究结合了土壤微生物组分析和生化分析，为可持续农业，特别是半干旱地区药用作物的生产提供了宝贵的见解。

研究区域位于中国甘肃省定西市，地处半干旱地区，年均降水量较低，地下水较深且难以用于灌溉，因此农业主要依赖降水。研究区域的土壤主要为黄土质，具有砂质至粉质的质地，通常养分和水分含量较低。根据FAO分类，这些土壤属于黄土性淋溶土，这在北方黄土高原的半干旱地区是典型的。自然植被稀疏，主要由草类、豆科植物和耐旱植物组成，包括*Medicago sativa*，同时还种植了马铃薯和*Astragalus* spp.。在施肥前测量了基线土壤性质，包括有机碳（C）、氮（N）和磷（P）。

实验于2022年9月启动，采用随机区组设计，每种处理有三个重复（每个处理区大小为4×5米），考虑了两个土壤深度（0–20厘米和20–50厘米）。施肥处理包括粪肥（MF）、堆肥（CF）和未施肥对照（CK）。在种植前，所有地块均匀施用基肥和追肥。*Astragalus*于2023年4月播种，2023年10月收获。肥料的营养成分在表S3中提供，具体堆肥过程请参阅补充材料。

在2023年和2024年作物成熟期，分别于10月10日和15日采集土壤样本。使用土壤钻头从每个地块的两个深度（0–20厘米和20–50厘米）取样。每个深度随机采集三个土壤芯，混合后得到每个处理重复和深度的单个代表性样本。实验包括三个处理：堆肥、对照和粪肥，每个处理有三个重复，共获得18个复合样本每年（3种处理×3个重复×2个深度）。在两年中采用相同的采样协议以确保一致性。土壤样品通过2毫米筛子去除石块和杂质。筛后的土壤分为三部分：（1）储存在4°C以测定溶解有机碳（DOC）、微生物生物量碳（MBC）和硝酸盐（NO??-N）；（2）储存在-80°C（一周）以提取微生物DNA；（3）风干用于物理化学分析。

土壤含水量（SWC）通过将土壤干燥至105°C 24小时后使用重力法测定。土壤pH值通过在土壤-水悬浮液（1:2.5，质量比）中使用复合电极（MP551，上海三新仪器公司）测定。硝酸盐氮（NO??-N）和铵盐氮（NH??-N）通过使用0.5 mol L?1 K?SO?溶液（土壤-溶液比为1:5）从新鲜土壤样品中提取，并使用自动离散化学分析仪（SMARTCHEM 200，AMS，意大利）进行定量。微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）通过氯仿熏蒸-提取法测定，并使用Multi C/N 3100分析仪（Analytik Jena，德国）进行测定。可利用磷（AP）通过使用0.5 mol L?1 NaHCO?提取（Olsen方法）测定。总磷（TP）通过浓硫酸消化后，使用钼蓝法进行分光光度测定。土壤有机碳（SOC）、溶解有机碳（DOC）、颗粒有机碳（POC）和电导率（EC）通过Wan等人（2024）描述的程序进行测定。所有分析均采用适当的空白和重复以确保数据质量和可重复性。有关分析精度和检测限的详细信息见补充材料。

土壤质量指数（SQI）的计算遵循Doran和Parkin（1994）的方法，仅考虑显著变化的土壤特性（p < 0.05）。每个变量的权重通过主成分分析（PCA）确定。多共线性通过方差膨胀因子（VIF）进行检验；2024年的样本中某些预测变量（如SOC、DOC、POC）表现出高共线性（VIF > 10），但保留以确保年份间的一致性并评估有机施肥是否能维持土壤质量。非线性评分方法用于标准化土壤指标，其中“更多是更好的”变量设为-2.5，而“更少是更好的”变量设为2.5。这一评分过程允许对相反方向的变量进行一致的解释。最后，SQI根据Andrews等人（2002）的方法确定，使用以下公式：

$$
SQI = \sum_{i=1}^{n} W_i \times S_i
$$

其中，'n'为土壤指标的数量，'W1'为PCA得出的权重，'S1'为第i个指标的标准化得分。

真菌DNA的提取使用E.Z.N.A.?土壤DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek，美国佐治亚州Norcross），按照制造商的说明进行。DNA质量通过1%琼脂糖凝胶电泳确认，纯度和数量通过分光光度计（ND2000；Thermo Scientific）测定。使用ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）引物扩增真菌ITS2区域，具体方法见补充材料。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行（BMKCloud，中国）。原始读数通过fastp v0.20.1进行质量过滤，使用FLASH v1.2.11合并，并通过UCHIME v4.2去除嵌合体。原始扩增子序列可在NCBI SRA下的BioProject PRJNA1189063中找到。

通过R语言中的phyloseq包计算α多样性指标（Simpson、Shannon和观察到的丰富度）。真菌群落组成通过基于Bray-Curtis不相似性的主坐标分析（PCoA）评估。使用RDA分析土壤特性对真菌群落组成的影响。共现网络使用igraph包构建，通过Pearson相关性（p < 0.05，|r| < 0.8）评估土壤变量与真菌属之间的关联。使用FUNGuild预测真菌功能群（Nguyen等人，2016）。通过随机森林（RF）模型识别关键土壤预测因子，并使用部分依赖图（PDP）进行可视化。通过线性和多元回归分析探讨土壤因子和微生物多样性之间的相关性。结构方程模型（SEM）使用lavaan包进行，以评估施肥（CK、CF、MF；以CK为参考变量）和土壤深度对土壤质量和真菌功能群的直接影响。模型拟合通过SRMR（≤0.08）、CFI（≥0.95）、卡方检验（p > 0.05）和RMSEA（≤0.05）进行评估。使用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验评估处理对土壤物理化学和微生物参数的影响，显著性水平设定为p < 0.05。数据正态性和方差齐性通过Shapiro-Wilk和Levene检验评估。OTU计数通过稀释处理以考虑测序深度差异。所有统计分析均在R（版本4.3.2）中进行。

施肥显著提高了*Astragalus*根生物量和土壤质量指数（SQI）与对照（CK）相比（p < 0.05）。堆肥（CF）和粪肥（MF）使平均根生物量分别比CK增加23.74%和22.38%。在2023/2024年，每种处理下的根生物量（均值±标准差，每种处理有20株植物）分别为MF：289.80 ± 1.53克，CF：286.59 ± 0.55克，CK：234.17 ± 3.81克，MF和CF处理下均出现显著增加。土壤质量随着深度增加而显著下降（p < 0.05），在所有处理中，MF和CF的土壤质量均高于CK。影响土壤质量的关键土壤指标包括SOC、MBN、POC、AP、DOC和NO??-N。MF和CF均显著改善了土壤特性，尤其是AP、NO??-N、SOC、DOC、MBC和MBN，相较于CK。大多数土壤特性随着深度增加和时间推移显著下降（表S4）。处理、深度和时间对大多数土壤参数的影响高度显著（p < 0.05），其中土壤深度对土壤性质的影响比处理或时间变化更为显著。此外，尽管某些土壤特性随时间下降，但有机改良措施下土壤质量保持稳定（p > 0.05），表明有机改良措施在长期维持土壤质量方面具有积极作用。

2023年，CF和MF处理下的真菌多样性与丰富度相较于CK有所下降，但未达到统计显著性（p > 0.05；表S6）。这一下降主要归因于有机施肥导致的养分富集，这种富集促进了特定类群的生长，特别是分解者，从而降低了整体生物多样性。线性模型显示，真菌多样性与较高的土壤养分水平呈负相关，尤其是微生物MBC和DOC（图S1）。2023年高养分水平支持了快速生长的copiotrophic分解者类群，其主导地位降低了群落的均匀性，导致多样性降低，尽管养分可用性增加。这表明养分富集使真菌群落向少数主导分解者转变，抑制了较少的类群，从而降低了整体多样性。到2024年，MF处理下的土壤养分水平相比2023年有所下降，导致copiotrophic分解者主导地位的降低。这使得次级类群和其他功能群的相对丰度增加，提高了群落的均匀性和整体多样性（MF：6.39 vs. CK：5.89和CF：4.75）。AP和DOC的正相关表明，适度的养分水平支持了更广泛的类群，从而形成了更平衡和多样化的真菌群落（图S2）。多元方差分析进一步显示，处理×年份的交互作用对真菌多样性和丰度的影响比处理×深度的交互作用更大。这表明，在2023年的单次施肥事件后，土壤养分可用性的时变性是真菌群落动态的主要驱动因素。

2023年，Ascomycota（64.0–82.5%）和Basidiomycota（5.2–15.0%）主导了真菌群落。在表层土壤中，MF和CF处理下Ascomycota的相对丰度增加（+29.9%和+18.3%），而深层土壤中增加幅度较小（+4.0%和+8.0%）。Basidiomycota在表层土壤中略有减少（?1.9%和?4.1%），但在深层土壤中增加（+2.4%和+3.2%）。到2024年，Ascomycota、Basidiomycota和Mortierellomycota共同占真菌群落的约85%。在表层土壤中，CF处理下Ascomycota减少（?14.6%），而MF处理下略有增加（+0.8%），而在深层土壤中，两者均减少（?3.7%和?0.7%）。Basidiomycota在表层土壤中减少（?10.4%和?3.8%），而在深层土壤中略有变化（+0.2%和?3.4%）。多元回归分析确定了影响主要真菌门类的土壤因素（图2c和d）。Ascomycota的丰度与土壤AP和NO??-N呈正相关，而Ascomycota和Basidiomycota分别与DOC和SOC呈显著负相关。

主坐标分析（PCoA）评估了不同处理和土壤深度下真菌群落组成的差异（图3a–d）。在2023年，PCoA1解释了32–34%的变异，而PCoA2解释了18–19%的变异。在2024年，PCoA1解释了35–38%的变异，PCoA2解释了18–23%的变异。冗余分析（RDA）进一步揭示了土壤因素对真菌群落变化的影响（图3e和f）。2023年，RDA1和RDA2分别解释了43.7%和24.9%的变异，而2024年，RDA1和RDA2分别解释了30.5%和24.5%的变异。主要影响真菌群落分布的土壤特性包括AP、SOC、DOC、NO??-N和NH??-N（表S7）。

网络分析揭示了土壤因素与真菌属之间的相互作用（图4a–f）。每个处理使用六个重复样本（n = 6），以确保网络分析的充分稳健性。MF和CF的网络复杂度指标，包括节点和边的数量、密度、平均度和模块性，均高于CK（表S8）。在2023年，MF显示出最高的网络连接性，有40个节点、252条边、密度为0.323，模块性为0.63。CF紧随其后，有226条边、密度为0.321，模块性为0.63，而CK有223条边、密度为0.31，模块性为0.55。在2024年，CF表现出最高的模块性（0.61），其次是MF（0.58）和CK（0.55）。MF还具有最高的正链接比例（52.4%）和最低的负链接比例（47.6%）。

进一步的网络结构分析显示，大多数Ascomycota属在有机改良措施下与关键土壤因素显著正相关（p < 0.05）。具体来说，在MF处理中，Ascomycota与SOC、DOC、POC、NO??-N和MBC显著相关。在CF处理中，Ascomycota与MBN、SOC、POC、NO??-N和NH??显著相关。这些模式与之前的研究一致，表明有机施肥通过改变土壤条件促进了真菌群落的转变。功能上，MF和CF网络中Ascomycota的主导地位强调了它们的适应性和生态重要性。这些真菌容易与植物根系形成共生关系，对有机质的分解、营养循环和病原体抑制起着至关重要的作用。有机施肥还似乎通过促进拮抗性真菌和增加网络复杂性，抑制了真菌病原体，从而增强了土壤的抗逆性。

结构方程模型（SEM）揭示了施肥和土壤深度对土壤质量指数（SQI）和真菌功能群的直接影响（图6a和b）。土壤质量随着深度增加而下降，表层土壤（0–20厘米）的SQI较高（0.71，p < 0.01），支持共生型真菌的丰度（0.317，ns）并减少病原体的丰度（?0.249，ns）。深层土壤的SQI较低（?0.741，p < 0.01），有利于分解型真菌（0.209，ns）和病原体（0.21，ns），同时减少了共生型真菌（?0.32）（图6b）。以CK为参考，CF和MF对SQI有显著正向影响（0.51和0.50，p < 0.05）。MF对分解型真菌有显著正向影响（0.63，p < 0.05），同时减少了共生型（?0.48，p < 0.01）和病原型（?0.37，p < 0.05）真菌。CF对这些功能群的影响较弱，大多不显著（图6a）。这些结果表明，施肥和土壤深度影响真菌功能群组成和土壤健康，响应营养可用性变化的真菌功能群之间存在明显的权衡。

有机施肥通过提高土壤养分状况和微生物群落的复杂性，显著改善了土壤质量（SQI）和*Astragalus*根生物量。尽管土壤特性随深度增加而减少，但有机改良措施下的土壤质量保持稳定，这表明有机改良措施在长期维持土壤质量方面具有积极作用。此外，土壤质量在两年中保持稳定，表明有机改良措施的长期效果可能更为显著。这些发现支持了有机施肥在提高作物产量、促进土壤养分状况和改善土壤质量方面的积极作用。

真菌功能群的多样性随时间变化而减少，这与第二年土壤养分水平下降相吻合，表明改良措施的影响可能是暂时的。然而，土壤质量保持稳定，这表明有机改良措施对土壤功能的改善具有持久性。未来的研究应评估这些积极影响是否能在两年后的土壤中持续存在，以进一步明确有机施肥对可持续作物生产的长期影响。

土壤深度是影响微生物多样性和群落组成的另一个关键环境梯度。我们的研究显示，随着土壤深度增加，真菌多样性和丰度显著下降。表层土壤富含有机质、养分和根系生物量，因此微生物的丰度和多样性较高。然而，深层土壤由于其独特的、通常不太适宜的生境，导致真菌多样性下降。此外，有机施肥显著提高了网络连接性、模块性和节点密度，表明有机改良措施下的真菌相互作用更加复杂和稳定。这些网络结构的变化可能源于有机肥提供的高养分异质性和多样化的有机基质，促进了真菌类群之间的生态位分化和协作关系。网络分析进一步揭示了土壤特性与有机改良措施下主导真菌类群之间的显著相关性。大多数Ascomycota类群与土壤DOC、POC、NO??-N和MBC显著正相关，反映了它们在养分丰富的环境中的copiotrophic生活方式和利用能力。相比之下，Basidiomycota类群与MBN呈显著负相关，但与AP呈正相关，表明它们对氮形式的敏感性和对磷富集环境的偏好。这些模式与之前的研究一致，表明有机施肥通过改变土壤条件促进了真菌群落的转变。

通过SEM分析，我们发现施肥和土壤深度对土壤质量（SQI）和真菌功能群有显著影响。表层土壤（0–20厘米）具有较高的SQI，有利于共生型真菌并减少病原体的丰度，而深层土壤（20–50厘米）则有利于分解型和病原型真菌。较高的养分水平、有机质和根系生物量在表层土壤中创造了有利于多样真菌群落和更好土壤质量的条件。深层土壤中分解型真菌的主导地位与它们在分解植物残体中的作用一致，表层真菌通常分解较简单的碳源，而深层真菌则专门分解复杂的物质。深层土壤中SQI较低主要归因于随着深度增加的土壤性质下降，这与之前的研究一致。

使用CK作为参考，MF和CF均提高了SQI，这与之前的研究一致，表明有机肥料能改善土壤质量。MF的影响最为显著，显著增加了分解型真菌的丰度，同时减少了共生型和病原型真菌的丰度，突显了在养分富集下真菌功能群之间的权衡。CF对这些功能群的影响较弱，大多不显著，这表明粪肥比堆肥更有效地重组真菌群落并提高分解潜力。养分富集减少了植物对共生体的依赖，限制了碳向共生型真菌的分配，并有利于分解型真菌分解有机质和循环养分。有机改良措施下病原型真菌的减少可能归因于竞争性相互作用和拮抗性微生物活动，可能由有益细菌如*Pseudomonas*介导。总体而言，这些结果表明，施肥和土壤深度的变化影响了真菌群落和土壤健康，有机改良措施，尤其是粪肥，鼓励了分解者群落，减少了病原体并提高了养分循环和生态系统稳定性。

本研究揭示了有机施肥对土壤质量和*Astragalus*根生物量的积极影响。MF和CF显著改善了土壤性质，包括SOC、DOC、NO??-N和AP，从而提高了*Astragalus*的根生物量。此外，有机改良措施通过促进分解型真菌的丰度，提高了土壤质量并增强了养分循环。这些结果支持了有机肥料在提高作物产量和土壤质量方面的积极作用。同时，有机改良措施通过改变真菌群落，促进了土壤健康和生态系统稳定性。土壤质量的稳定性和真菌群落的复杂性表明，有机改良措施在可持续农业中具有重要应用价值，尤其是在半干旱地区。未来的研究应进一步探讨这些影响的长期效应，以更好地理解有机改良措施对可持续农业的贡献。