研究用棕榈酸、油酸以及棕榈酸/油酸组合处理后的HepG2细胞中细胞凋亡的过程

《Arab Journal of Gastroenterology》：Investigating the process of apoptosis in HepG2 cells treated with palmitate, oleate, and palmitate/oleate combination

非酒精性脂肪肝（NAFLD）中脂滴积累与肝细胞凋亡机制研究。通过分析棕榈酸（palmitate）和油酸（oleate）单独及联合处理对HepG2细胞的影响，发现棕榈酸显著诱导脂滴堆积和促凋亡基因（p53、Bax、FasL）上调，而油酸具有较弱促脂毒性和一定保护作用。联合处理（P&O）脂滴积累效应增强但细胞毒性降低，提示脂肪酸比例失衡是NAFLD关键诱因。脂毒性通过激活内质网应激和氧化应激通路驱动凋亡，为代谢综合征相关肝病治疗提供新靶点。

　　

萨玛内·托拉比（Samaneh Torabi）|亚瑟·穆罕默迪（Yaser Mohammadi）|莫塔哈雷·萨达特·侯赛尼（Motahareh-sadat Hoseini）|阿特娜·雷扎伊（Atena Rezaei）|阿里·穆罕默迪（Ali Mohammadi）|埃尔哈姆·巴赫雷尼（Elham Bahreini）

伊朗医科大学医学学院生物化学系，德黑兰，伊朗

摘要

引言

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是最常见的慢性肝病，其特征是超过5%的肝细胞中积累了脂滴（LD）。本研究旨在探讨HepG2细胞在暴露于棕榈酸、油酸以及棕榈酸和油酸组合时的细胞凋亡情况。

方法

使用MTT测定法确定了棕榈酸和油酸的有效浓度。随后，选择了一种最佳的脂肪酸组合剂量来诱导脂滴的形成。通过Oil Red O染色和光学显微镜对不同浓度的棕榈酸和油酸处理后的细胞内脂滴积累进行了定性和半定量分析。利用实时PCR技术量化了与细胞凋亡相关的基因（p53、Bax、FasL和Bcl-2）的表达水平。

结果

棕榈酸处理显著降低了细胞密度并增强了脂滴的积累，而油酸的影响较轻。棕榈酸-油酸（P&O）组合比单独使用油酸时诱导了更多的脂滴积累，但其细胞毒性低于棕榈酸单独使用。在分子水平上，促凋亡基因（P53、Bax和FasL）在所有处理组中均上调，其中P&O组的表达水平最高。相反，抗凋亡基因Bcl-2在棕榈酸处理的细胞中显著下调。

结论

饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸对脂质稳态和肝细胞存活率具有不同的影响，但之间存在相互关联。维持这两种脂肪酸的适当平衡可能对预防肝损伤至关重要。需要进一步的研究来阐明其背后的机制。

引言

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是全球最常见的慢性肝病，其特征是超过5%的肝细胞中积累了脂滴[1]。该疾病与代谢综合征、肥胖和2型糖尿病密切相关，影响了全球约25%的人口，构成了一个重大的公共卫生挑战[2]。其疾病谱从单纯的脂肪变性发展到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、纤维化，最终可能发展为肝细胞癌（HCC）[3]。游离脂肪酸（FFAs），尤其是饱和脂肪酸，引起的脂毒性在触发肝细胞凋亡中起着关键作用[4]。尽管细胞凋亡对于维持组织稳态至关重要，但其失调会加速肝病的进展[5]。

饱和脂肪酸（如棕榈酸）和不饱和脂肪酸（如油酸）对肝细胞有不同的影响。棕榈酸会引发内质网（ER）应激并产生活性氧（ROS），从而激活凋亡途径。例如，Cho等人证明棕榈酸会上调CHOP和Xbp-1基因的表达，导致ER应激[6]。相比之下，由于油酸的不饱和结构，它表现出相对的抗凋亡作用[5]。本研究中使用的棕榈酸/油酸（P/O）比例模拟了现代饮食模式（如西方饮食）的组成，这些饮食富含饱和脂肪酸（如动物脂肪和加工食品中的棕榈酸）和不饱和脂肪酸（如橄榄油和坚果中的油酸）。这一比例对于模拟NAFLD至关重要，因为它反映了这些脂肪酸在促进脂质积累和细胞应激方面的协同作用，这是NAFLD进展的关键驱动因素[7,8]。研究它们的联合效应有助于了解饮食中的脂肪酸谱如何影响脂毒性和肝细胞凋亡，填补了理解NAFLD发病机制的一个重要空白。

调控细胞凋亡的关键基因包括p53、Bcl-2、Bax和FasL。p53基因是一个核心调节因子，在细胞应激下被激活，并诱导内在和外在的凋亡途径[9]。已有超过50%的HCC病例报告了p53突变，突显了其在肝病中的关键作用[10]。Bcl-2家族的蛋白质，包括抗凋亡的Bcl-2和促凋亡的Bax，调节线粒体膜通透性和细胞色素C的释放[11]。此外，FasL通过与Fas死亡受体结合来激活caspases，加速外在凋亡途径[12]。

本研究旨在探讨HepG2细胞在棕榈酸、油酸以及棕榈酸和油酸组合处理下的细胞凋亡过程。通过评估p53、Bcl-2、Bax和FasL的表达，本研究加深了对脂毒性条件下细胞死亡机制的理解，并为寻找NAFLD相关肝病的新治疗靶点奠定了基础。

材料与试剂

实验中使用了以下材料：棕榈酸（目录编号：P0500，Sigma-Aldrich，美国），油酸（目录编号：01008，Sigma-Aldrich，美国），含GlutaMAX补充剂的Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient混合物F-12（DMEM/F12-Glutamax，目录编号：LM-D1116/500，BioSera，英国），10倍胰蛋白酶-EDTA（目录编号：XC-T1717/100，BioSera，英国），青霉素-链霉素溶液（目录编号：XC-A4122/100，BioSera，法国），胎牛血清（FBS，目录编号：F-1001/100，AnaCell，伊朗），MTT

脂肪酸对HepG2细胞存活率的影响

为了确定用于处理HepG2细胞的棕榈酸、油酸及其组合（P&O）的适当浓度，使用MTT测定法在24小时和48小时时评估了这些脂肪酸对细胞存活率的细胞毒性效应。确定了每种处理的IC₅₀值，即使细胞存活率降低50%的脂肪酸浓度。图1-A显示，24小时后的棕榈酸IC₅₀约为0.8 μM，48小时后降至0.7 μM（图1-B）。对于油酸，

讨论

本研究表明，棕榈酸、油酸及其组合（P&O）处理对脂滴积累和细胞凋亡有不同的影响。棕榈酸处理显著降低了细胞密度并显著增加了脂滴的积累，而油酸的影响较轻。棕榈酸-油酸组合比单独使用油酸时诱导了更多的脂质积累，但其毒性低于棕榈酸单独使用。在分子水平上，促凋亡基因p53、Bax和FasL的表达水平均升高

结论

本研究表明，棕榈酸和油酸对HepG2细胞的脂质代谢和细胞凋亡有不同的影响。棕榈酸通过增加脂滴积累和上调促凋亡基因（p53、Bax、FasL）诱导脂毒性和细胞凋亡，而油酸则缓解了脂质应激，表现出保护作用。然而，棕榈酸和油酸的组合协同作用增加了脂滴积累并上调了与程序性细胞死亡相关的基因表达

局限性

本研究使用了HepG2细胞，这是一种广泛使用的体外NAFLD模型，因为它们能够积累脂滴，对游离脂肪酸（棕榈酸和油酸）产生反应，并表达与细胞凋亡相关的基因，同时具有易于培养、高增殖能力和遗传稳定性[13,15,34]。虽然HepG2细胞可以再现诸如甘油三酯合成和内质网应激反应等关键代谢途径，但由于其肿瘤起源（肝细胞癌），它们与原代细胞存在差异

贡献

E.B.和S.T.构思了这项研究，E.B.设计了实验方法，S.T.、M.H.、A.R.和A.M.进行了实验，E.B.和Y.M.分析了数据，Y.M.起草了初稿。E.B.监督了整个研究过程，所有作者都阅读并批准了最终修订后的手稿。

资助

不适用。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢伊朗医科大学临床生物化学系的工作人员对本研究的宝贵贡献。