CAP-CD56+CD271+骨髓间充质细胞（BMSCs）外泌的PVA/SA缓释水凝胶能够延缓软骨细胞的衰老，并改善腰椎小关节的骨关节炎症状

《Bioactive Materials》：CAP-CD56+CD271+ BMSCs exos-loaded PVA/SA sustained-release hydrogel attenuates chondrocyte senescence and ameliorates lumbar facet joint osteoarthritis

软骨靶向递送系统治疗腰椎小关节退行性变的机制研究。该研究通过单细胞测序筛选出CD56+CD271+ BMSCs亚群，其外泌体经CAP肽修饰后结合PVA/SA水凝胶缓释系统，靶向递送miR-210-3p抑制HIF-3α表达，显著改善软骨结构，抑制细胞衰老和基质降解。

　　这项研究致力于开发一种针对腰椎关节骨关节炎（LFJ OA）的新疗法，通过识别具有强大软骨再生能力的骨髓间充质干细胞（BMSC）亚群，对其外泌体（Exos）进行定向输送工程化处理，并将其整合到一个缓释水凝胶系统中。研究还旨在揭示该疗法的潜在分子机制，为LFJ OA的治疗提供一种创新且高效的解决方案。

LFJ OA是一种常见的导致下背痛（LBP）的疾病，严重影响患者的生活质量并带来巨大的经济负担。根据研究数据，LFJ OA的患病率在全球范围内接近80%的终身发生率。作为脊柱中唯一的滑膜关节，腰椎关节的结构和功能与椎间盘的纤维软骨连接有显著区别。因此，LFJ OA的治疗策略需要特别关注软骨再生和细胞衰老问题。软骨细胞的异常（如细胞衰老）以及其功能障碍（如细胞外基质（ECM）合成与降解能力受损）在LFJ OA的发病机制和进展中起着关键作用。在关节退化过程中，衰老细胞的增加会加速关节软骨的破坏，而抑制细胞衰老有助于改善软骨细胞的稳定性并延缓骨关节炎的进展。

BMSC是一种具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞，近年来因其在软骨再生中的应用潜力而受到广泛关注。BMSC可以分化为多种细胞类型，包括软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。从BMSC中提取的软骨细胞可以产生富含II型胶原蛋白的ECM，这在关节软骨再生中发挥重要作用。此外，BMSC悬浮液的局部注射已被证明可以修复兔子的骨软骨缺损。BMSC与支架的结合可进一步增强骨软骨缺损的软骨修复能力。这些研究结果表明，基于干细胞的组织工程策略仍是软骨再生的重要方法和研究方向。然而，MSCs具有高度异质性，其组成复杂且纯度相对较低，这显著限制了其在临床中的广泛应用。因此，深入研究MSCs的不同亚群，明确其特定功能，并探索这些亚群之间的相互关系，对于准确解读临床试验结果和提高MSCs相关治疗的有效性至关重要。

通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，研究者成功揭示了BMSCs的异质性，并识别出具有特定功能的MSCs亚群。然而，与软骨再生直接相关的MSCs亚群仍然缺乏充分的研究。因此，本研究中，研究人员通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，识别并分离出具有强大软骨再生能力的CD56⁺CD271⁺ BMSCs亚群，并提取其外泌体（CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos）。随后，这些外泌体被修饰为具有软骨细胞特异性靶向功能的CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos。为了实现外泌体的持续释放，研究团队开发了一种由聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）组成的复合水凝胶作为缓释载体。最终，研究人员对这种复合系统在体外和体内治疗LFJ OA的效果进行了系统评估，并探索了其分子机制。

研究结果显示，与传统BMSCs相比，CD56⁺CD271⁺ BMSCs亚群及其来源的外泌体表现出显著增强的促软骨生成和抗衰老能力。CAP修饰显著提高了外泌体在体内的靶向效率，而PVA/SA水凝胶则能够实现外泌体的持续释放，延长其在损伤部位的滞留时间。将CAP-Exos与PVA/SA水凝胶结合后，植入该系统的显著改善了软骨结构，增加了基质沉积，并抑制了基质金属蛋白酶-13（MMP-13）和衰老标志物（如p16/p21/p53）的表达。机制研究表明，外泌体介导的miR-210-3p的传递可抑制软骨细胞中的HIF-3α表达。这些治疗效果在miR-210-3p被阻断或HIF-3α过表达时被逆转。

综上所述，这种CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos-PVA/SA水凝胶缓释系统为LFJ OA提供了一种有前景且有效的治疗方案。

在方法部分，研究人员通过scRNA-seq分析了CD271⁺ 骨髓单核细胞（BMMCs）的转录组数据，并利用图谱聚类分析将细胞分为10个不同的簇（标记为0–9）。其中，簇0和9表现出高表达的BMSC标志基因，如NT5E（CD73）、NGFR（CD271）、CD90和CD105。主要细胞类型是根据标志基因的表达来识别的。簇1和4被鉴定为巨噬细胞，其特征是LILRA4和GZMB的高表达；簇2被鉴定为中性粒细胞，其特征是S100A8和S100A9的高表达；簇7和8被鉴定为B细胞，其特征是CD19和MS4A1的高表达；簇5被鉴定为T细胞，其特征是CD3的高表达；簇6被鉴定为网织红细胞，其特征是HBA1的高表达。这些结果与之前的研究一致，表明CD271⁺ BMMCs构成一个异质性细胞群体。为了进一步探索BMSCs的异质性，研究人员从高表达NT5E和NGFR的细胞中提取，进行子聚类分析，将BMSCs分为六个不同的亚群。其中，NCAM（CD56）在簇4中高度富集。

在结果部分，研究人员通过FACS技术从人类骨髓中分离出CD56⁺CD271⁺ BMSCs，并对其进行了表型分析。结果显示，这些细胞具有较高的CD90和CD73表达，同时CD11b和CD45的表达低于2%，表明其未被内皮细胞、免疫细胞和红细胞污染。此外，CD56和CD271的阳性率均超过95%，表明CD56⁺CD271⁺ 亚群在培养后仍保持其独特的表型。显微镜成像显示，CD56⁺CD271⁺ BMSCs表现出类似成纤维细胞的形态。多向分化实验确认了这些细胞的干细胞特性，包括分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的能力。

为了进一步评估CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos的靶向性和生物相容性，研究人员使用了PVA/SA复合水凝胶作为缓释载体。扫描电子显微镜（SEM）显示，SA水凝胶具有粗糙的表面结构，PVA水凝胶具有更多孔的结构，而PVA/SA复合水凝胶则结合了微小的孔径和粗糙的表面纹理。这种独特的结构有助于外泌体的附着和随后的缓慢释放。注射性和血液相容性评估显示，所有水凝胶均显示出良好的光交联能力。溶血实验显示，所有水凝胶之间没有显著差异，表明其对红细胞具有保护作用。流变学分析显示，PVA/SA复合水凝胶的储存模量（G′）高于其他水凝胶，表明其具有更高的弹性和更稳定的内部结构。同时，其较低的损耗模量（G″）证实了其具有固态行为和优异的机械稳定性。这些增强的流变学特性表明，PVA/SA复合水凝胶比其他水凝胶更适合维持腰椎关节腔内的结构完整性。粘附测试显示，PVA/SA复合水凝胶具有更强的粘附性，从而促进外泌体的附着。细胞活力实验表明，与水凝胶共培养至3天不会影响软骨细胞的活力。此外，主要器官的组织学评估显示，水凝胶植入不会引起显著的器官毒性，包括心脏、肝脏、脾脏、肺部和肾脏。

为了进一步评估CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos的靶向性和生物相容性，研究人员使用PKH26标记的外泌体与新型PVA/SA复合水凝胶结合，评估其在体内的释放和细胞摄取。结果表明，外泌体在整个水凝胶基质中均匀分布。释放曲线显示，封装的外泌体在体外具有持续释放的特性。值得注意的是，经过28天后，PVA/SA复合水凝胶保留了比单独PVA或SA水凝胶更多的外泌体，证实了其优越的外泌体附着能力。释放动力学显示，封装的外泌体在体内具有持续释放的特性。值得注意的是，经过28天后，PVA/SA复合水凝胶保留了比单独PVA或SA水凝胶更多的外泌体，证实了其优越的外泌体保留能力。此外，28天后释放的外泌体的粒径分布与原始外泌体一致，未观察到明显的聚集或降解现象，表明该缓释系统能够有效保持外泌体的结构完整性。

为了验证该缓释系统在体内促进软骨再生和改善细胞衰老的效果，研究人员在小鼠模型中植入了CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos-PVA/SA水凝胶。免疫荧光显微镜显示，CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos在软骨细胞中表现出显著增强的富集，相较于未修饰的CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos。组织学评估显示，CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos-PVA/SA水凝胶和CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos-PVA/SA水凝胶组表现出更有序的软骨细胞排列、更少的细胞间隙和更完整的软骨基质。相反，对照组和BMSCs Exos-PVA/SA水凝胶组表现出紊乱的软骨细胞排列、扩大的细胞间隙和明显的裂隙/缺陷。苏木精-伊红（H&E）染色和软骨基质评分（OASRI评分）进一步支持了该治疗策略在促进软骨基质合成和修复方面的有效性。

为了进一步评估CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos对软骨细胞再生和细胞衰老的体外影响，研究人员使用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的软骨细胞模型。结果表明，CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos显著增加了软骨细胞中II型胶原蛋白的表达，并减少了MMP-13和p21/p53的表达，这些蛋白在TNF-α诱导的细胞衰老中被上调。此外，WB结果和SA-β-gal染色进一步证实了CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos显著增加了衰老标志物p16、p21和p53的表达。这些发现表明，CAP-CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos在体外显著促进软骨细胞再生并减轻细胞衰老。

为了进一步探索CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos在LFJ OA中促进软骨再生的分子机制，研究人员进行了miRNA测序。结果发现，CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos中高表达的miRNA包括miR-210-3p、miR-31-3p和miR-502-3p。其中，miR-210-3p在之前的报道中被认为与软骨再生密切相关，因此被选为后续研究的靶向分子。为了验证CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos是否能够将miR-210-3p递送至软骨细胞，研究人员进行了荧光原位杂交（FISH）实验。结果显示，miR-210-3p主要富集在软骨层和软骨下骨区域，且在CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos-PVA/SA水凝胶组中的表达显著高于BMSCs Exos水凝胶组。这些发现表明，CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos能够有效地将miR-210-3p递送至软骨细胞并上调其表达。此外，先前的研究表明，miR-210-3p通过抑制软骨下骨血管生成来抑制OA的进展。因此，miR-210-3p的表达上调可能有助于改善软骨细胞的再生能力和减少细胞衰老。

为了进一步验证miR-210-3p在CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos对软骨再生的促进作用，研究人员使用miR-210-3p抑制剂来下调其表达。结果表明，miR-210-3p的下调显著减弱了CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos对LFJ OA的有益效果。组织学分析显示，miR-210-3p抑制剂处理的CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos-PVA/SA水凝胶组的软骨细胞排列紊乱，细胞间隙扩大，软骨基质中的裂隙/缺陷明显。苏木精-伊红（H&E）染色和软骨基质评分（OASRI评分）进一步支持了这一现象。因此，miR-210-3p在CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos促进软骨再生和减轻细胞衰老方面起着关键作用。

在讨论部分，研究人员指出，尽管CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos在体外和体内均表现出显著的治疗效果，但其临床转化仍面临挑战。首先，该治疗策略高度依赖于特定的FACS分离的亚群，而供体因素（如年龄、性别和基础健康状况）可能显著影响CD56⁺CD271⁺细胞及其外泌体的比例、纯度和功能活性，导致批次间差异。这种固有的生物学差异是实现标准化、大规模生产一致疗效的障碍，也是成功临床应用的前提。因此，后续研究应解决供体依赖性和标准化瓶颈，并系统评估该疗法在更广泛人群中的可重复性和适用性。关键的突破方向包括开发永生化细胞系以确保稳定的外泌体供应，或探索“无细胞”策略（如化学合成的CAP-miR-210-3p脂质体）以避免细胞培养的不确定性。从临床应用的角度来看，最直接的设想是通过影像引导将这种外泌体-水凝胶复合物微创注射到受影响的腰椎关节中，为患有严重LFJ OA的患者提供一种有前景的无细胞替代方案。

此外，研究人员还探讨了外泌体在治疗中的作用机制。外泌体携带多种生物活性成分，可以通过细胞间通讯将这些成分传递到靶细胞。在软骨再生中，miR-210-3p通过多种机制促进软骨组织的再生能力，包括促进软骨细胞分化并抑制脂肪细胞分化。在体外和体内实验中，研究人员确认了miR-210-3p在促进软骨再生和减轻细胞衰老中的显著贡献。为了理解其作用，研究人员使用miR-210-3p抑制剂来下调其表达，结果表明，miR-210-3p的下调显著减弱了CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos对LFJ OA的有益效果，突显了该miRNA在功能恢复中的关键作用。然而，抑制剂仅部分逆转了CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos对软骨基质降解和细胞衰老的改善作用，表明其治疗效果可能来源于多种生物活性分子的协同作用。因此，进一步研究应探讨CD271⁺CD56⁺ BMSCs Exos是否通过其他因素增强软骨修复。

在讨论中，研究人员还指出，HIF-3α是HIF家族成员之一，其在软骨稳态中起着关键的负调控作用。不同于促进软骨生成的HIF-1α，HIF-3α通过抑制其他HIF同源体的转录活性间接阻碍软骨再生。具体来说，HIF-3α会竞争性地结合到HIF-1α靶基因的启动子区域，直接抑制HIF-1α驱动的软骨细胞分化和ECM合成通路。这种抑制作用会导致关键基质成分（如II型胶原蛋白和蛋白聚糖）的显著减少。同时，在损伤微环境中，异常激活的HIF-3α会通过非典型TGF-β通路引发信号传导，促进MSCs向纤维软骨表型的转分化，这会沉积机械性能较差的I型胶原蛋白，而非II型胶原蛋白，从而损害再生组织的功能完整性。因此，靶向抑制HIF-3α或恢复HIF同源体之间的动态平衡被认为是一种有前景的治疗策略，以提高软骨再生的疗效。本研究证实了CD56⁺CD271⁺ BMSCs Exos来源的miR-210-3p能够抑制HIF-3α的表达，促进软骨再生并减轻细胞衰老。

综上所述，该研究为LFJ OA的治疗提供了一种创新的、基于外泌体的无细胞治疗策略，其核心在于通过靶向外泌体和缓释水凝胶的结合，实现对软骨细胞的定向作用和持续的生物活性释放。该方法在促进软骨再生和减轻细胞衰老方面表现出显著的治疗潜力，为未来的临床转化提供了坚实的基础。然而，为了进一步推进该策略的临床应用，还需要解决供体依赖性和标准化问题，并探索更多具有稳定性和可重复性的生物材料和治疗方案。