基于嘌呤-2,6-二酮的多靶点定向配体通过抑制PDE/TRPA1/CHIT1来治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）：一种新的治疗方法

《Bioorganic Chemistry》：Purine-2,6-dione-based multitarget-directed ligands inhibiting PDE/TRPA1/CHIT1 as a new approach for the treatment of COPD

COPD靶向新型化合物研究：合成8-氨基嘌呤-2,6-二酮丁酰胺衍生物，证实其多靶点抑制（PDE4/8、TRPA1、CHIT1）及抗炎抗纤维化活性，化合物39在体内模型中效果优于roflumilast，抑制NLRP3炎症小体激活。

　　慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种高度普遍且常常致命的呼吸系统疾病。目前的治疗方法虽然在一定程度上能够缓解症状，但并不能完全针对慢性炎症的发病机制，因此，开发新的、更具针对性的治疗策略对于管理与该疾病相关的炎症过程至关重要。本研究中，科学家们合成了一系列新型的8-氨基嘌呤-2,6-二酮丁酰胺化合物，并评估了它们对PDE（磷酸二酯酶）、TRPA1（瞬时受体电位香草酸受体1）和CHIT1（几丁质酶1）的联合抑制活性。研究发现，其中最具有前景的多功能配体21、39和47在基于人体气道细胞的模型中表现出显著的抗炎和抗纤维化活性，其效果优于参考化合物IBMX和HC-030031。此外，配体39和47在体外实验中展示了更强的支气管舒张效果，甚至超过了茶碱和罗氟司特（Rof）的效果。体外药物代谢动力学（ADME-Tox）数据以及体内研究的药代动力学结果证实了这些化合物具有良好的药物特性，包括代谢稳定性、无肝毒性、良好的被动转运能力和良好的肺部渗透性。特别地，化合物39在弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中表现出与罗氟司特相当的疗效，同时降低了NLRP3炎症小体的激活水平，从而抑制了NF-κB的磷酸化。这些发现表明，化合物39的多功能活性可能为COPD的治疗提供了一种新的、有希望的策略。

COPD是一种长期的疾病，会导致多种呼吸系统症状，如气短、咳嗽、痰液产生和呼吸困难，这些症状会显著降低患者的生活质量。根据世界卫生组织的数据，2019年全球COPD的患病率达到了10.3%，而到了2020年，这一数字略微上升至10.6%。COPD的患病率随着年龄的增长而增加，从35-44岁年轻人中的0.2%上升到85岁人群中的10%。在美国，COPD是2021年第六大死亡原因，导致超过138,000例死亡。预计到2030年，COPD将成为全球第三大死亡原因。COPD的分子发病机制主要涉及慢性炎症对中央和外围气道、肺泡、肺实质和肺血管的影响。反复的损伤和修复过程会导致气道重塑（AR）、气道内黏液分泌腺体增大、肺泡丢失、杯状细胞数量增加以及血管床的变化，这些变化可能进一步引发肺动脉高压。科学证据表明，NOD样受体家族、含吡rin结构域3（NLRP3）炎症小体的持续激活可能在COPD的发病机制中起重要作用。

当前COPD的治疗主要依赖吸入性糖皮质激素联合支气管扩张剂（如M3受体拮抗剂或β2-肾上腺素受体激动剂），以及最近开发的、选择性抑制磷酸二酯酶（PDE）4的口服药物罗氟司特（Rof）。此外，新型的吸入式药物Ensifentrine作为一种双重PDE3和PDE4抑制剂，具有支气管保护和抗炎作用，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于COPD的治疗。然而，现有的或实验性的治疗方法都无法完全针对COPD慢性炎症的发病机制。因此，迫切需要开发新的、更具针对性的治疗策略，以管理与该疾病相关的炎症过程，从而有助于预防气道重塑或与肺纤维化相关的病理过程。

环状腺苷酸（cAMP）和环状鸟苷酸（cGMP）在调节肺部多种细胞功能中起着关键作用，包括异常气道平滑肌细胞（ASMC）的增殖和迁移，以及炎症介质的分泌。研究表明，PDE抑制剂，尤其是对cAMP特异性异构体如PDE4、PDE7和PDE8具有选择性的药物，能够维持细胞内高水平的cAMP，从而减少细胞因子的产生并发挥抗炎作用。此外，这些酶在人类细胞中广泛分布，涉及多种呼吸系统疾病的治疗。有趣的是，PDE1和PDE4抑制剂已被证明可以预防人ASMC的病理性重塑，而PDE7的抑制则能够抑制炎症过程。相比之下，PDE8的抑制，尤其是在ASMC中高度表达的情况下，与异丙肾上腺素（β2激动剂）联合使用时，能够显著减少ASMC的增殖，这提示了PDE8可能具有抗纤维化的作用。目前市场上仅有少数PDE8抑制剂可用，包括双效PDE5/8抑制剂二吡啶醇（Dipyridamole）和PDE4/8抑制剂BC8–15，以及强效、选择性的PDE8抑制剂PF-49573259。基于这些数据，针对PDE1、PDE3、PDE4、PDE7和PDE8的新型第二代、非选择性PDE抑制剂可能比第一代非选择性PDE抑制剂如茶碱（Theo）或选择性PDE4抑制剂表现出更优越的临床疗效。

近年来，瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）通道拮抗剂被认为是治疗慢性气道炎症疾病（如哮喘和COPD）的重要策略之一。TRPA1通道是TRP阳离子通道家族的28个成员之一，主要表达于几乎覆盖整个呼吸系统的C纤维上，作为气道刺激物的化学感受器，如丙烯醛、臭氧、香烟烟雾和氯气等。此外，TRPA1也存在于多种非神经细胞类型中，包括肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞和气道平滑肌细胞（在人类和小鼠中均有所发现）。TRPA1通道的激活会导致神经性炎症、黏液分泌和反射反应，如打喷嚏、咳嗽、支气管痉挛、呼吸抑制和回避行为。因此，TRPA1通道拮抗剂可能具有抗炎特性，并能抑制慢性呼吸道疾病中的气道高反应性。事实上，在卵白蛋白诱导的小鼠哮喘模型中，使用TRPA1阻断剂HC-030031（如图1所示）可以减少细胞因子、趋化因子和神经递质的诱导，以及白细胞浸润和气道高反应性。然而，慢性呼吸道疾病不仅涉及肺部的炎症，还包括气道重塑和纤维化。现有证据表明，TRPA1通道的激活可能在肺纤维化的形成过程中具有保护作用。因此，TRPA1在促进人类肺成纤维细胞中纤维化信号传导的作用仍需进一步研究。

最近的研究发现，哺乳动物几丁质酶——几丁三糖酶（CHIT1）在人类肺部和循环系统中高度表达，可能参与哮喘、COPD和肺部感染的分子发病机制。CHIT1被认为是由组织激活的巨噬细胞主要产生的几丁质酶，并且在肺纤维化动物模型中被报道可以调节转化生长因子β（TGF-β）和白细胞介素13（IL-13）信号通路，从而促进纤维化反应。其过度表达会刺激肺泡巨噬细胞和中性粒细胞，促进气道炎症，并引发支气管高反应性。目前，几丁质酶抑制剂（如OATD-01）已被用于哮喘和特发性肺纤维化（IPF）的治疗研究，并且OATD-01在治疗活动性肺结节病中的疗效和安全性也得到了评估。此外，咖啡因、茶碱和戊四醇酯（PTX）等黄嘌呤类化合物在高微摩尔浓度下已被证明是细菌、真菌和人类几丁质酶的竞争性抑制剂。PTX在治疗肺结节病方面表现出疗效，并且与泼尼松龙联合使用可以减轻长期类固醇治疗的严重副作用。PTX还被发现对非中性粒细胞缺乏的小鼠侵袭性肺曲霉病模型具有治疗效果，其相关分子机制可能与CHIT1的抑制有关。这些数据表明，通过药理学手段抑制CHIT1可能为气道疾病患者带来益处，而黄嘌呤核心结构可能成为新型抑制剂的有希望基础。

基于这些积极的研究结果，科学家们设计了一种新型的1,3-二甲基-2,6-二氧代嘌呤-7-基丁酰胺化合物系列（III，图1）。该系列的合成方法包括在嘌呤-2,6-二酮核心的第8位引入各种烷基氨基和芳基烷基氨基基团，以及在苯环上引入不同的取代基，或用苯乙胺基团取代邻氨基苯基。鉴于PDE抑制和TRPA1阻断的联合作用具有广阔的前景，因此继续对基于嘌呤-2,6-二酮骨架的化合物进行结构-活性关系（SAR）研究显得尤为重要。同时，探索同时抑制CHIT1在气道炎症中的潜在意义也是一个全新的概念。由于PDE（尤其是PDE1、PDE3、PDE4、PDE7和PDE8）、TRPA1通道和CHIT1在多种参与气道炎症发病机制的细胞中同时表达，因此，通过多功能导向配体（MTDL）同时靶向这些蛋白可能为治疗慢性呼吸道疾病（如COPD）提供一种全新的、有希望的策略。

本研究中，科学家们对新型的1,3-二甲基-2,6-二氧代嘌呤-7-基丁酰胺化合物系列（III，图1和表1）进行了化学、生物、药理和药代动力学研究。这些研究揭示了新型MTDLs，它们能够同时抑制PDE、TRPA1和CHIT1。通过分子建模研究，科学家们解释了这些化合物在体外观察到的多功能活性。随后，对选定的化合物进行了体外实验，以评估其抗炎和抗纤维化特性。此外，还对这些化合物的支气管舒张活性进行了体外评估。同时，还研究了这些新化合物的代谢稳定性以及其安全性和药代动力学特征。最终，针对化合物39，评估了其在弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中的疗效，包括其对NLRP3炎症小体激活和核因子κB（NF-κB）磷酸化的影响。

在合成方面，设计的化合物19-51通过多步骤的化学反应合成，如图1所示。第一步是将8-溴-1,3-二甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮（8-BrTheo）中的溴原子替换为氨基基团，从而得到中间体1-6[[32], [33], [34], [35]]。这些中间体随后在第7位进行烷基化反应，与乙基-4-丁酸酯反应，生成相应的乙酯衍生物：新化合物7和8，以及之前报道的化合物9-18。这一合成过程展示了科学家们在开发新型药物分子方面的技术能力，并为后续的生物活性研究奠定了基础。

在研究结果方面，化合物21、39和47在体外实验中表现出最强的抑制活性，并在基于人体气道细胞的模型中显示出抗炎和抗纤维化特性。这些化合物的支气管舒张效果在分离的鼠气管模型中被观察到。此外，化合物39和47在体外实验中表现出良好的代谢稳定性，且无肝毒性，同时具有良好的被动转运能力和肺部渗透性。这些特性表明，这些化合物具有作为潜在药物的良好前景。在体内实验中，化合物39在弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中表现出显著的疗效，其效果与罗氟司特相当，并且能够显著降低NLRP3炎症小体的激活水平，从而抑制NF-κB的磷酸化。这些发现为COPD的治疗提供了一种新的策略，即通过多功能导向配体同时靶向PDE、TRPA1和CHIT1，从而更全面地干预疾病相关炎症过程。

在研究方法上，科学家们采用了一系列实验手段，包括体外和体内实验，以全面评估新化合物的药理活性和药代动力学特性。体外实验主要涉及对化合物的抗炎和抗纤维化活性进行评估，而体内实验则关注其在动物模型中的实际疗效。此外，分子建模研究为理解化合物的多功能活性提供了理论支持，帮助科学家们预测其与目标蛋白的结合模式，并优化其结构设计。这些研究不仅展示了化合物的生物活性，还揭示了其潜在的临床应用价值。

在作者贡献方面，Gra?yna Ch?oń-Rzepa负责撰写和编辑研究论文，进行可视化、项目管理、方法设计、实验执行、资金获取、数据分析和概念设计。Katarzyna Wójcik-Pszczo?a参与了论文的撰写、可视化、资源管理、方法设计、实验执行和数据整理。Marietta ?lusarczyk负责方法设计和实验执行，并进行了数据分析。Alicja Gawalska参与了可视化和实验执行。Adam Bucki负责资源管理和实验执行。这些贡献表明，研究团队在药物开发的各个环节中都发挥了重要作用，从化合物的设计到实验的执行，再到数据的分析和论文的撰写。

在研究的资助方面，本研究得到了波兰国家科学中心（National Science Centre Poland）的资助，项目编号为2018/29/B/NZ7/00285。此外，研究中使用的Monolith NT.115 p（NanoTemper Technologies，德国）和Trans-Blot Turbo Transfer System（BioRad，美国）设备也得到了来自雅盖隆大学优先研究领域qLIFE的战略卓越计划的资助。这些资助支持了研究的顺利进行，确保了实验设备的先进性和数据的准确性。

研究的结论强调了新合成的化合物在治疗COPD方面的潜力。这些化合物不仅具有抗炎和抗纤维化特性，还表现出良好的支气管舒张效果，这为COPD的治疗提供了新的方向。同时，研究还指出，通过同时靶向PDE、TRPA1和CHIT1，这些多功能导向配体可能在治疗其他慢性呼吸道疾病方面也具有应用前景。科学家们认为，这一研究为未来开发更有效的COPD治疗药物提供了重要的理论和实践基础，并为进一步探索多功能药物的结构和活性关系奠定了基础。