一种高度敏感的比率荧光探针，用于可视化铁死亡（ferroptosis）和药物诱导的氧化应激过程中HOBr的波动

《Bioorganic Chemistry》：A highly sensitive ratiometric fluorescent probe for visualizing the fluctuations of HOBr during ferroptosis and drug-induced oxidative stress

本研究设计了一种基于1,8-萘酰亚胺的比率荧光探针Py-NA，用于高灵敏度检测铁死亡和药物诱导氧化应激中的HOBr浓度变化。该探针具有76nM的低检测限、20秒内快速响应，并具备良好的细胞相容性和ER靶向能力，成功应用于细胞内HOBr动态监测。

　　

郭冰鹏|刘一帆|徐浩杰|孙硕|李宝英|于琳燕|邵长香

齐鲁工业大学（山东科学院）化学与化学工程学院，中国济南250103

摘要

在铁死亡和药物诱导的氧化应激过程中，次溴酸（HOBr）浓度的动态变化对于阐明铁死亡的机制、推进相关疾病的病理研究以及评估抗癌药物的效果至关重要。本研究设计并合成了一种基于萘酰亚胺的高灵敏度（LOD = 76 nM）和快速响应（20秒内）的比率荧光探针（Py-NA），用于检测HOBr。该探针能够在5–30 μM的范围内定量且比率地检测HOBr，并具有高选择性。此外，它具有良好的生物相容性、出色的内质网（ER）靶向能力，并已成功应用于活细胞中内源性和外源性HOBr的比率荧光成像。重要的是，Py-NA能够在细胞环境中实现铁死亡和药物诱导的氧化应激过程中HOBr水平的荧光成像分析。

引言

活性氧（ROS），包括过氧化氢（H₂O₂）、次氯酸（HOCl）、过氧亚硝酸盐（ONOO^?）和次溴酸（HOBr），主要在细胞线粒体的呼吸过程中产生，也可以由外源性药物和感染因子等外部刺激诱导[[1], [2], [3]]。ROS在多种生理过程中起着关键作用，包括神经信号传导、血压调节和细胞免疫[[4], [5], [6]]。ROS水平的失调会破坏细胞内的氧化还原平衡，从而导致各种疾病的发病[[7], [8], [9]]。值得注意的是，铁死亡和药物诱导的氧化应激都与细胞内的ROS水平密切相关[[10], [11], [12]]。因此，研究铁死亡和药物诱导的氧化应激过程中ROS的动态浓度变化对于阐明铁死亡的机制、推进相关疾病的病理研究以及评估抗癌治疗的效果具有重要意义。

荧光探针因其高灵敏度、优异的生物相容性和优越的时空分辨率而被广泛用于ROS监测[[13], [14], [15], [16], [17],[19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]]。尽管已经开发了许多荧光探针来监测铁死亡和药物诱导的氧化应激过程中特定ROS（如ONOO^?、H₂O₂和HOCl）的动态变化[[26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33]]，但目前尚无专门用于检测这些过程中HOBr变化的探针。这可能是由于体内HOBr的浓度相对较低，需要更高灵敏度的探针来进行准确监测。此外，大多数现有的HOBr检测荧光探针采用单波长模式（开启或关闭）工作（表S1）[[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]]，使得它们的信号容易受到探针浓度、微环境变化和激发强度的干扰。相比之下，比率荧光探针通过双波长测量实现自我校准，从而在复杂的生物系统中提供更准确的目标分析物定量[42,43,45,46]。因此，迫切需要一种高灵敏度的比率HOBr探针来监测铁死亡和药物诱导的氧化应激过程中的细胞内HOBr变化。

本研究利用HOBr介导的氨基和硫醚基团的环化反应，设计了一种比率荧光探针Py-NA，使用1,8-萘酰亚胺作为荧光团来检测HOBr。Py-NA本身具有黄绿色荧光，在与HOBr反应后由于π共轭系统的扩展而转变为粉红色。这一反应伴随着最大发射峰从556 nm红移至610 nm。该探针具有快速响应时间（< 20秒）、高选择性和定量比率检测能力，以及优异的灵敏度（检测限 = 76 nM）。此外，Py-NA具有良好的生物相容性和出色的ER靶向能力，能够在活细胞中可视化内源性和外源性HOBr。值得注意的是，Py-NA已成功应用于MDA-MB-231细胞中铁死亡和药物诱导的氧化应激过程中HOBr变化的监测。

Py-NA的合成

合成路线如图S1所示。将化合物2（123.3 mg，0.31 mmol）、2-甲基硫苯硼酸（78.7 mg，0.46 mmol）、[Pd(dppf)Cl?]（20 mg，0.027 mmol）和K?CO?（427.8 mg，3.1 mmol）混合在H?O/THF（10.0 mL，1.4 v/v）中，在N?氛围下回流8小时。冷却至室温后，用50 mL水稀释反应混合物，并用25 mL二氯甲烷提取三次。合并的有机提取物在真空中浓缩，剩余物...

Py-NA对HOBr的特征光谱、传感机制和响应时间

为了评估Py-NA在体外检测HOBr的分析性能，我们首先记录了其光谱特性。如图1a所示，Py-NA具有黄绿色荧光，最大发射波长为556 nm。与HOBr反应后，发射波长显著红移，产生强烈的粉红色荧光，峰值位于610 nm。吸收光谱中也观察到了相应的红移（图1b）。加入HOBr后，最大吸收波长从425 nm红移至470 nm...

结论

总之，我们开发了一种基于萘酰亚胺的比率荧光探针Py-NA，用于检测HOBr。该探针表现出高选择性、快速响应（< 20秒）和定量检测能力等优异特性。值得注意的是，Py-NA对HOBr的灵敏度极高，LOD为76 nM。其低细胞毒性和出色的ER靶向能力使其能够在活细胞中高效成像内源性和外源性HOBr。具体来说，我们...

CRediT作者贡献声明

郭冰鹏：撰写——原始草案、资源准备、方法学设计。刘一帆：验证、方法学设计、数据管理。徐浩杰：方法学设计、实验研究、数据管理。孙硕：实验研究、数据分析。李宝英：撰写——原始草案、方法学设计、数据分析。于琳燕：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供。邵长香：撰写——审稿与编辑、监督、资源提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

^‖郭冰鹏和^‖刘一帆对这项工作做出了同等贡献。我们感谢国家自然科学基金（编号：22309105）、山东省自然科学基金（编号：ZR2022QB215, ZR2022QB227 和 ZR2024QH255）以及山东省高等学校青年教师创新计划（编号：2024KJN008）的财政支持。该项目还得到了齐鲁工业大学山东科学院的培养项目支持...