《Bioorganic Chemistry》：Revisiting amifostine as a potential NDM-1 inhibitor for combatting bacteria resistance
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抗NDM-1产酶大肠杆菌的氨甲环乙烷联合亚胺培南协同治疗研究，揭示amifostine通过稳定锌离子口袋氢键抑制酶活性，显著降低MIC值并改善小鼠存活率。
魏高强|董翱|李晓婷|刘瑞萌|张秀英
东北农业大学兽医学院，中国哈尔滨香坊区长江路600号，邮编150030
摘要
产生NDM-1的革兰氏阴性病原体的全球性流行显著削弱了碳青霉烯类抗生素的临床疗效，加剧了细菌耐药性问题。因此，迫切需要开发新的抑制剂来抑制NDM-1，以应对由此引发的感染。在本研究中，我们重新评估了阿米福斯汀（AMI）的潜力。阿米福斯汀的半抑制浓度（IC50）为25.4±0.6 μM，并能以剂量依赖的方式显著抑制NDM-1的水解活性，表明其具有作为NDM-1抑制剂的潜力。体外实验表明，阿米福斯汀能有效恢复美罗培南（MEM）对NDM-1阳性大肠杆菌的抗菌活性，使MEM的最低抑菌浓度（MIC）从64 μg/ml降至16 μg/ml。阿米福斯汀与美罗培南联合使用表现出显著的协同效应，FICI指数为0.375。体内实验中，该组合在感染NDM-1阳性大肠杆菌的小鼠中表现出协同治疗效果：与对照组相比，联合使用显著提高了小鼠的存活率，减少了细菌负荷和与NDM-1阳性大肠杆菌相关的炎症反应，并减轻了组织病理损伤。进一步的研究表明，阿米福斯汀通过改变细菌细胞膜的通透性促进了药物进入细胞。分子动力学模拟和分子相互作用分析显示，阿米福斯汀能与NDM-1活性口袋中的关键氨基酸残基（包括Asn220、Gln123和Glu152）形成稳定的氢键，从而竞争性地抑制NDM-1的美罗培南水解活性。本研究为NDM-1抑制剂的开发提供了一个新的框架，为对抗耐药菌感染提供了新的策略。
引言
抗菌素耐药性（AMR）已成为21世纪全球公共卫生的最大威胁之一。据最新报告，每年约有三分之一的全球人口受到AMR相关感染的影响，这对低收入和中等收入国家构成了特别严重的威胁[[1], [2], [3]]。在耐药病原体中，产生碳青霉烯酶的细菌严重削弱了碳青霉烯类抗生素的疗效——这些抗生素被称为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后手段”[[4]]。特别是新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1）的快速全球传播，已将医疗系统推向了“后抗生素时代”的边缘[[5], [6], [7]]。
NDM-1是一种由质粒编码的金属β-内酰胺酶，几乎可以水解所有β-内酰胺类抗生素，包括碳青霉烯类和高级头孢菌素，导致治疗失败[[8], [9], [10]]。其催化口袋含有两个Zn2+离子，这些离子与关键残基结合以促进β-内酰胺环的断裂[[11,12]]。此外，blaNDM-1基因经常与IncA/C和IncF等移动遗传元件相关联，使得细菌能够在物种间水平转移[[13]]。与mcr等其他耐药决定因子共同携带时，NDM-1进一步增强了细菌的生存能力，通过降低膜通透性和赋予多重耐药性[[14,15]]。因此，产生NDM-1的病原体已演变成“超级细菌”，对人类健康和全球食品安全构成了重大威胁[[16]]。
尽管全球做出了广泛努力，但至今仍未发现具有临床疗效的NDM-1抑制剂。传统的药物发现途径受到高成本、漫长开发时间和低成功率的限制[[17]]。许多实验性抑制剂虽然体外活性强，但由于药代动力学特性差、细胞毒性或细胞渗透性有限而在临床上失败[[9,18,19]]。这些挑战凸显了一个关键的研究空白——缺乏经过验证有效性和安全性的临床可用NDM-1抑制剂。
药物再利用（DRP）提供了一种强大且高效的方法来填补这一空白。通过利用已获准用于人类的化合物，DRP可以绕过早期毒性筛选，降低开发成本，并加速临床转化[[20], [21], [22]]。最近有研究表明，几种非抗菌药物（如二氧嘧啶、氢化嘧啶和硫醇）具有潜在的NDM-1抑制作用，验证了这种方法的可行性[[23,24]]。然而，这些研究大多停留在现象学层面，对再利用药物在分子水平上的作用机制了解有限，而这对于合理优化和治疗应用至关重要。
为填补这一知识空白，我们假设阿米福斯汀（AMI）作为一种临床批准的细胞保护剂，可以通过结合到活性位点的Zn2+口袋中，改变酶的催化动力学，从而恢复碳青霉烯类抗生素的疗效，成为有效的NDM-1抑制剂。在本研究中，我们通过分子对接、分子动力学（MD）模拟、酶动力学以及体外和体内协同效应测定，系统地研究了阿米福斯汀对NDM-1的抑制机制。这种综合方法为将阿米福斯汀重新定位为潜在的NDM-1抑制剂提供了坚实的机制基础，并为通过药物再利用来对抗抗菌素耐药性提供了战略范例。
实验部分
NDM-1重组蛋白表达
NDM-1蛋白在实验室中通过BL21(DE3)-pET-32a(+)-blaNDM-1质粒表达并纯化。通过双酶消化验证后，用于后续研究（图1A-B）。表达和纯化后，重组NDM-1蛋白的浓度约为1.8 mg/mL，纯度超过90%（图1C-D）。在本研究中，我们确定了阿米福斯汀的抑制率（IR为83.7%，IC50=25.4±0.6 μM），证明其具有抑制NDM-1的潜力
结论
总之，阿米福斯汀被重新定位为一种抗NDM-1抑制剂。阿米福斯汀直接与NDM-1活性位点中的关键氨基酸和Zn2+结合，竞争性地抑制NDM-1对β-内酰胺类抗生素的水解活性。体外实验表明，阿米福斯汀显著抑制了NDM-1的生物活性，并恢复了美罗培南对NDM-1阳性大肠杆菌的抗菌活性。此外，阿米福斯汀与美罗培南（10 mg/kg + 10 mg/kg）联合使用的药效结果也是一致的
细菌菌株和化学品
我们实验室保存了NDM-1阳性大肠杆菌和BL21(DE3)-pET-32a(+)-blaNDM-1质粒。阿米福斯汀（≥95%）和美罗培南（≥95%）均来自Target Mol（美国马萨诸塞州波士顿）。动物实验
实验所用BALB/c雌性小鼠年龄为6至8周（体重在18至22克之间），由辽宁长盛生物技术有限公司提供，并在实验前进行了适应期。所有实验均严格遵循东北农业大学动物健康与利用委员会的要求进行作者贡献声明
魏高强：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，实验研究，数据分析。董翱：实验研究，数据分析。李晓婷：撰写 – 初稿，监督，实验研究，数据分析。刘瑞萌：实验研究，数据分析。张秀英：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，监督，实验研究，资金获取，数据分析，概念构思。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号32273060）的支持。实验工作在东北农业大学动物医学院完成。感谢东北农业大学提供的实验平台，以及白静文教授在计算机技术方面的支持，国家自然科学基金的资金支持，以及FIGDRAW的技术支持。
