三种甘油-3-磷酸脱氢酶异构体在盐生杜氏藻（Dunaliella salina）的甘油和脂质代谢中的不同作用及其对生物柴油生产的意义

《Bioresource Technology》：Divergent roles of three glycerol-3-phosphate dehydrogenase isoforms in glycerol and lipid metabolism of Dunaliella salina and their implications for biodiesel production

G3P合成酶（GPDH）同源体在盐胁迫响应及脂质代谢中的作用研究。揭示了D. salina中三个GPDH同源体DsGPDH1-3的亚细胞定位差异及功能分化：DsGPDH2在叶绿体中响应盐胁迫促进甘油合成，而DsGPDH1/3在细胞质中不响应胁迫。异源表达证实三者在盐耐受和甘油合成中的功能，DsGPDH3显著提升脂质积累且饱和脂肪酸比例增加，但生长和色素含量降低。该研究为盐生微藻生物燃料工程提供了新靶点。

　　

Jv-Liang Dai|Ling Xiao|Yue-Li Yuan|Ming-Hua Liang|Jian-Guo Jiang

华南理工大学食品科学与工程学院，中国广州510640

摘要

甘油-3-磷酸（G3P）是脂质和甘油合成的关键前体，通过G3P脱氢酶（GPDH）进行合成，但特定GPDH亚型在Dunaliella salina中的作用仍不清楚。在本研究中，从D. salina CCAP 19/18中鉴定出三种多结构域GPDH，分别命名为DsGPDH1、DsGPDH2和DsGPDH3。DsGPD2定位于叶绿体中，并在盐胁迫下上调表达，而DsGPDH1和DsGPD3则位于细胞质中，且没有表现出响应。将这三种亚型异源表达在盐敏感的Saccharomyces cerevisiae Δgpd1和Escherichia coli中，证实了它们在耐盐性和甘油合成中的作用。内源性过表达这三种亚型增强了脂质积累和脂肪酸饱和度，其中DsGPD3产生的脂质含量最高，DsGPD1则使饱和度增加最多，尽管其生长和色素含量有所下降。本研究揭示了GPDH亚型在甘油和脂质代谢中的不同作用，突显了它们作为基于微藻的生物燃料生产工程目标的潜力。

引言

Dunaliella salina是一种耐盐的单细胞绿藻，以其能够在广泛的NaCl浓度（0.05至5.5 M）范围内存活以及对外部渗透压变化的快速响应能力而著称（Polle等人，2020年）。其极强的耐盐性主要归因于其独特的细胞结构和特有的甘油代谢途径（Oren，2017年）。当环境盐浓度发生变化时，D. salina细胞可以迅速调整其体积和形状，因为它们没有坚硬的细胞壁，而是被弹性膜包裹（Oren，2005年）。随后，细胞内会大量合成或降解甘油以平衡渗透压，使细胞恢复到原来的大小并继续生长（Oren，2017年）。据报道，在4 M NaCl中生长的D. salina细胞含有约7.8 M的甘油，相当于72%的水溶性甘油，这表明快速的甘油循环对于D. salina抵抗盐胁迫至关重要（Gunde-Cimerman等人，2018年）。

D. salina中的甘油循环涉及四种主要酶，包括NAD依赖的GPDH、甘油-3-磷酸磷酸酶（G3PP）、二羟基丙酮还原酶（DHAR）和二羟基丙酮激酶（DHAK）（Chen等人，2012年；Gunde-Cimerman等人，2018年）。二羟基丙酮磷酸（DHAP）在GPDH的作用下生成甘油-3-磷酸（G3P），随后G3PP将其转化为甘油。甘油还可以通过DHAR和DHAK依次生成二羟基丙酮（DHA）和DHAP，从而完成降解过程。在这四种酶中，GPDH被认为是调节渗透休克后甘油水平的限速酶（Cai等人，2013年）。在D. salina 435菌株中发现了五种GPDH亚型，它们的表达受到氧化应激、渗透压应激和盐胁迫等多种非生物因素的诱导（Wu等人，2019年）。对这些GPDH的序列分析表明，其中四种在N端含有经典的GPDH结构域与磷丝氨酸磷酸酶（PSP）结构域的融合（He等人，2007年；Wu等人，2019年）。同样，D. salina CCAP 19/18的基因组测序显示存在多达五个编码具有两个结构域的GPDH的基因（Polle等人，2020年）。体外实验证明，其中一种独特的GPDH可以直接催化二羟基丙酮磷酸到甘油的转化（He等人，2020年）。虽然之前的研究已经描述了D. salina中GPDH的表达和双结构域特性，但对其亚细胞定位、启动子活性和在甘油合成中的不同代谢功能的系统比较尚缺乏。

G3P作为甘油合成的中间产物，也是肯尼迪途径中合成的三酰甘油（TAG）的重要前体，因此GPDH也参与脂质代谢（Yan等人，2025年）。短期和长期的高盐胁迫会导致D. salina细胞中中性脂质和总脂质含量的增加（Ahmed等人，2017年；Yao等人，2016年）。这表明，在高盐胁迫下，D. salina中GPDH催化的G3P并不全部用于甘油合成，部分也用于TAG的合成。通过RNA干扰抑制Chlamydomonas reinhardtii中的GPDH2和GPDH3表达，导致TAG含量显著下降（Driver等人，2017年；Morales-Sánchez等人，2017年）。在硅藻Phaeodactylum tricornutum中过表达内源性GPDH增加了甘油和总脂质的含量，转化体还含有更高的单不饱和脂肪酸和较低的多不饱和脂肪酸（Yao等人，2014年）。因此，GPDH活性对微藻的脂质合成至关重要，但其在D. salina中的具体作用尚不清楚。

在本研究中，我们探讨了D. salina CCAP 19/18中的三种GPDH亚型在甘油合成和脂质代谢中的作用。DsGPDH1、DsGPDH2和DsGPDH3都含有PSP和GPDH双结构域，并具有不同的亚细胞定位。DsGPDH2对盐胁迫有响应，而DsGPDH1和DsGPD3则没有，这可能与它们启动子上的顺式作用元件有关。随后，在Saccharomyces cerevisiae Δgpd1和Escherichia coli中的异源表达证实了这三种亚型在耐盐性和甘油合成中的作用。将这三种GPDH亚型的ORFs克隆到质粒pDOE中，获得重组质粒，然后将其转入D. salina中进行过表达。通过比较正常和高盐条件培养的野生型与转化体之间的生长、色素含量、脂质含量和脂肪酸组成差异，证明了GPDH在D. salina中的脂质代谢中的重要性。

部分摘录

藻类菌株和培养条件

Dunaliella salina CCAP19/18来自藻类和原生动物培养库（CCAP）（https://www.ccap.ac.uk/）。D. salina细胞通常在含有87.69 g/L NaCl、0.42 g/L NaNO₃、0.015 g/L NaH₂PO₄·2H₂O、1.23 g/L MgSO₄·7H₂O、0.074 g/L KCl和0.044 g/L CaCl₂·2H₂O的Dunaliella培养基中培养。培养基还添加了0.5 mL/L的Fe-EDTA溶液（0.244 g/L FeCl₃·6H₂O、0.189 g/L Na₂EDTA）和1 mL/L的微量元素溶液（2.86 g/L H

三种DsGPDH亚型的序列特征

先前在D. salina CCAP 19/18的基因组中鉴定出五个编码双功能GPDH的基因（Dusal.1194 s00002.1、Dusal.0486 s00010.1、Dusal.0246 s00004.1和一个未注释的基因），未发现编码单功能GPDH的基因（Polle等人，2020年）。其中，Dusal.1194 s00002.1和Dusal.0486 s00010.1编码完整的GPDH，而Dusal.0246 s00004.1和Dusal.0832 s00001.1仅编码GPDH的N端结构域。在本研究中，我们进一步研究了这三种...

结论

本研究全面表征了来自耐盐微藻D. salina的三种GPDH亚型DsGPDH1、DsGPDH2和DsGPDH3，阐明了它们在甘油合成和脂质代谢中的不同作用。我们发现D. salina中的甘油合成途径包括细胞质途径（涉及GPDH1和GPDH3）和叶绿体途径（涉及GPDH2），且叶绿体途径对盐胁迫具有响应性。这三种亚型都对脂质积累做出了显著贡献。

CRediT作者贡献声明

Jv-Liang Dai：撰写——原始草稿、软件开发、实验研究、数据分析、概念构建。Ling Xiao：软件开发、方法设计、实验研究。Yue-Li Yuan：软件开发、实验研究。Ming-Hua Liang：实验指导、资源获取、资金争取。Jian-Guo Jiang：撰写——审稿与编辑、实验指导、资源获取、资金争取、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本项目得到了国家自然科学基金（32072201、32372286、32470058）和广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515011967、2023A1515012223、2025A1515010835）的支持。