通过原子力显微镜（AFM）和扫描射电光谱显微镜（SRS）技术揭示了普通小球藻（Chlorella vulgaris）细胞壁成分的表面依赖性重组现象

《The Cell Surface》：Surface-dependent reorganization of Chlorella vulgaris cell wall components revealed by AFM and SRS microscopy

细胞壁重组与 immobilization 策略的关联性研究：采用 PO-Chitosan 涂层、Superfrost? 正电荷表面和 PDMS 机械约束三种 immobilization 方法，结合 AFM 和 SRS 微scopy，发现不同方法显著影响微藻 Chlorella vulgaris 的表面粗糙度（11.1 vs 4.8 nm）、弹性模量（1.57 vs 0.12 MPa）及表面电荷分布，并揭示脂质（如 PUFA）和多糖的重组机制。研究证实 immobilization 策略不仅是固定手段，更是改变细胞壁纳米尺度特性的关键因素，为生物力学测量提供标准化参考。

　　本研究探讨了不同细胞固定方法对微藻细胞壁生物物理特性的显著影响，特别关注了在不同固定表面下，微藻细胞表面的物理特性、化学特性以及机械性能如何发生变化。研究对象是广泛应用于生物技术领域的微藻——*Chlorella vulgaris*。通过原子力显微镜（AFM）和化学力显微镜（CFM）技术，我们比较了细胞在不同固定表面上的表现，分析了附着力、表面相互作用和杨氏模量的变化。此外，我们还使用刺激拉曼散射（SRS）显微镜技术，进一步揭示了固定表面如何影响细胞壁分子的分布。研究结果表明，细胞固定方法的选择对微藻细胞壁的结构和表面特性具有重要影响，因此在进行微藻相关生物物理测量时，必须高度重视固定策略的科学性和合理性。

### 微藻细胞壁的复杂性与研究意义

微藻作为光合微生物，其细胞壁在生物技术应用中具有重要意义。细胞壁不仅是维持细胞形态的重要结构，还承担着细胞与外界环境之间相互作用的媒介功能。在不同的生长阶段，微藻细胞壁的组成和结构会发生显著变化。例如，在培养过程中，*Chlorella vulgaris* 细胞壁会从光滑表面逐渐转变为纤维状结构，这一过程受到细胞生长周期和培养条件的影响。细胞壁通常由脂质、蛋白质、类似几丁质的多糖和中性糖组成，其内部同时包含刚性与柔性的成分。这些复杂的结构和组成使得对细胞壁的准确表征变得尤为困难。此外，细胞壁的表面特性，如疏水性和表面电荷，对细胞与不同基质的相互作用起着关键作用，因此，研究这些表面特性如何在不同固定策略下发生变化，对于理解微藻在不同条件下的行为具有重要意义。

### 固定策略对细胞壁特性的影响

本研究中，我们选择了三种不同的固定策略：PO-壳聚糖涂覆的玻璃载玻片、PDMS腔室以及正电荷的Superfrost?玻璃载玻片。每种策略都通过不同的机制实现细胞固定。PO-壳聚糖载玻片主要通过疏水相互作用实现固定，而Superfrost?载玻片则通过疏水与静电相互作用结合固定。PDMS腔室则是通过机械约束来固定细胞。这些策略在实验条件上保持一致，以确保结果的可比性。

AFM成像、纳米压痕和力谱实验的结果显示，细胞壁的生物物理特性高度依赖于所采用的固定策略。具体而言，PO-壳聚糖载玻片上的细胞表现出较高的表面粗糙度、更高的刚性、较强的疏水性和正电荷特征。相比之下，Superfrost?载玻片上的细胞表面更光滑，细胞壁更柔软，疏水性较低，并且未检测到明显的正电荷。PDMS腔室中的细胞则表现出最光滑和最柔软的细胞壁，其表面具有亲水性和无电荷特征。这些结果表明，不同的固定策略可能引起细胞壁成分的重新组织，从而改变细胞表面的物理化学和机械特性。

### 表面化学性质对细胞固定的影响

为了进一步理解不同固定表面的化学特性如何影响细胞固定，我们使用了功能化的AFM探针进行实验。其中，甲基终止探针（CH?）用于探测疏水性表面，而羧基终止探针（COOH）用于探测带负电荷的表面。结果显示，PO-壳聚糖载玻片在CH?探针下表现出较高的附着力，这表明其具有较强的疏水性。然而，Superfrost?载玻片在COOH探针下检测到了少量的附着力，这表明其表面存在一定的正电荷。PDMS腔室则在所有探针下均表现出较低的附着力，表明其主要通过机械约束固定细胞，而非通过稳定的化学相互作用。

这些发现表明，不同固定策略不仅影响细胞的固定效果，还可能改变细胞壁成分的分布和排列。例如，PO-壳聚糖载玻片可能促进脂质微域的形成，从而增强疏水性。而Superfrost?载玻片的正电荷可能促进多糖的展开，增加其接触面积，进而影响细胞壁的刚性和表面特性。PDMS腔室的亲水性和负电荷则可能使脂质分布更加均匀，避免局部聚集，从而导致细胞壁呈现更光滑和柔软的特性。

### SRS显微镜揭示细胞壁成分的重新组织

为了进一步验证固定策略对细胞壁成分的影响，我们使用了SRS显微镜技术。该技术能够在不使用标记物的情况下，通过探测特定分子的振动模式，直接分析细胞壁的脂质组成。结果显示，不同固定策略下，细胞壁中的脂质分布发生了显著变化。在PO-壳聚糖载玻片上，细胞壁中的饱和脂肪酸（1449 cm?1）和不饱和脂肪酸（1661 cm?1）的信号强度不同，表明脂质在细胞表面发生了重新排列。具体而言，Superfrost?载玻片上的细胞表现出更高的不饱和脂肪酸信号，这可能与其较高的表面流动性有关。

此外，SRS数据还表明，细胞壁的脂质分布并非均匀，而是受到固定策略的影响。例如，PO-壳聚糖载玻片可能促进了脂质微域的形成，而Superfrost?载玻片则可能使脂质分布更加均匀，从而减少表面粗糙度。PDMS腔室中的细胞则表现出更均匀的脂质分布，这可能与其亲水性和无电荷特性有关。这些结果支持了我们的假设，即不同的固定策略可能导致细胞壁成分的重新组织，从而影响细胞表面的物理化学特性。

### 未来研究方向与应用价值

本研究的结果不仅揭示了固定策略对微藻细胞壁特性的影响，还强调了在进行AFM测量时，固定方法选择的重要性。由于细胞壁的动态性，不同固定策略可能选择性地固定不同发育阶段的细胞，从而影响测量结果。例如，PO-壳聚糖载玻片可能更倾向于固定成熟的细胞，而Superfrost?载玻片可能更适用于固定年轻的细胞。因此，未来的研究可以进一步探索其他固定策略，如Cell-Tak?、Vectabond?或聚-L-赖氨酸（poly-l-lysine）等，以更全面地理解固定策略对细胞壁结构的影响。

此外，本研究还指出，固定策略的选择不仅影响细胞壁的结构，还可能影响其功能特性。例如，脂质的重新分布可能影响细胞膜的流动性，进而影响细胞的代谢活性和表面相互作用。因此，在微藻研究中，选择合适的固定策略对于确保测量结果的准确性和可比性至关重要。未来的研究可以结合时间分辨的AFM和SRS测量，以动态监测细胞壁在固定过程中的变化。同时，结合机械映射和高分辨率组成分析，可以更深入地探讨刚性、附着力和分子组织之间的关系。

### 结论

综上所述，本研究展示了不同固定策略对*Chlorella vulgaris*细胞壁生物物理特性的重要影响。PO-壳聚糖载玻片、Superfrost?载玻片和PDMS腔室分别通过疏水相互作用、疏水与静电相互作用以及机械约束实现细胞固定。这些固定方法不仅改变了细胞的固定效果，还可能通过诱导细胞壁成分的重新组织，影响细胞表面的物理化学特性。因此，在进行微藻相关的生物物理测量时，必须仔细选择和验证固定策略，以确保数据的准确性和可比性。未来的研究可以进一步扩展固定策略的范围，以更全面地理解机械约束与生物化学相互作用对细胞壁结构的影响，并探索标准化的固定方法，以提高微藻研究的可重复性和跨研究的可比性。