转录组分析揭示了鸡卵泡发育过程中卵泡膜层细胞在特定阶段的胆固醇代谢和类固醇生成情况

《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Transcriptomic analysis reveals stage-specific cholesterol metabolism and steroidogenic in theca layer cells during follicular development in chickens

胆固醇代谢与类固醇激素合成基因在鸡间质细胞层（TLs）不同发育阶段（小黄体 SYFT、F6T、F1T）的差异化表达及调控机制研究。

　　卵巢卵泡的发育对于家禽的产蛋性能具有至关重要的影响。卵泡主要由颗粒层细胞（GLs）和卵泡膜层细胞（TLs）组成，而TLs在调控卵泡发育中的作用仍不完全清楚。本研究通过转录组分析，探讨了鸡TLs在小黄卵泡（SYFT）、最小级卵泡（F6T）和最大级卵泡（F1T）中差异表达基因（DEGs）的丰富度。研究结果表明，高丰富度的DEGs主要与胆固醇代谢（如MSMO1、NPC1）和类固醇激素合成（如STAR、CYP11A1、CYP19A1、POR、NR0B1）相关。值得注意的是，参与类固醇激素合成的基因（如STAR、CYP11A1和CYP19A1）在F6T阶段表现出显著的高表达。F6T阶段的上调DEGs主要富集于代谢通路，包括叶酸介导的一碳池和柠檬酸循环，这些通路有助于该阶段胆固醇合成的增加（如MSMO1）。而在SYFT阶段，胆固醇代谢相关基因（如NPC1、NR0B1和POR）则较为突出，上调的DEGs与细胞分化相关的信号通路，如Wnt和mTOR通路相关。关键基因如CYP19A1、CYP17A1、POR、NPC1、VLDLR和NR0B1主要出现在特征图谱3和1中，这些图谱通过趋势分析揭示了显著的表达模式。主要的KEGG通路包括细胞周期、同源重组、代谢和运输。本研究指出，TLs在小黄卵泡阶段主要参与胆固醇的运输，而在级卵泡阶段则转向胆固醇的合成和类固醇生成，揭示了调控鸡卵泡发育的关键转录程序。

卵泡的发育是家禽繁殖性能和产蛋持续性的核心因素。这一复杂的生物过程包括前级卵泡和级卵泡，后者也被称为排卵前卵泡。级卵泡是从小黄卵泡（SYF）中筛选出来的，并迅速发育为排卵前卵泡（Johnson, 2015）。在结构上，鸟类卵泡主要由卵母细胞、颗粒层细胞（GLs）和卵泡膜层细胞（TLs）构成（Caicedo Rivas等，2016）。卵泡的发育需要GLs和TLs之间的协调作用（Chen等，2019；Zhang等，2024b；Tian等，2025；Xia等，2025）。GLs通过其调控的增殖、分化和凋亡，在卵泡选择和快速生长中发挥关键作用（Tang等，2022；Wei等，2024；Zhang等，2024a）。虽然GLs在卵泡发育中处于中心位置，但TLs的协同作用同样不可或缺，尤其是在类固醇生成方面（Gomez等，1998；Hrabia等，2012；Zhang等，2024c）。在哺乳动物中，“两细胞、两促性腺激素”理论指出，TLs最初产生雄激素，随后由GLs转化为雌二醇（Edson等，2009）。然而，在鸟类中，TLs负责在卵泡类固醇生成过程中产生雌二醇（Lee等，1998）。这强调了深入研究胆固醇代谢，作为类固醇激素的主要前体，对于理解TLs功能的重要性。尽管已有研究探讨了颗粒层细胞中胆固醇含量与激素生成之间的关系，但结果仍存在一定的不一致性（Zhang等，2024a；Yu等，2025）。因此，有必要进一步阐明TLs中参与胆固醇代谢的基因。然而，目前关于TLs中类固醇代谢机制的研究仍较为有限。

随着组学测序技术和实验方法的进步，许多影响TLs类固醇生成的基因已被识别，进一步证明了它们在卵泡发育中的关键作用（Gan等，2017；Wang等，2017；Jing等，2018）。已有多个研究通过实验验证和组学数据识别出影响TLs功能的候选基因（Jing等，2018；Zhou等，2020；Hu等，2024）。Kang等（2017）首次证明，在鸡中，miR-26a-5p通过结合TNRC6A促进TLs的增殖。Zhou等（2020）发现，在TLs中，gga-miR-135a-5p的表达水平显著高于颗粒层细胞，并通过靶向KLF4、ATP8A1和CPLX1基因确认了其功能。Hu等（2024）整合了mRNA和miRNA的表达谱，揭示了miR-202-5p可能通过靶向CHPT1基因调节鹅TLs的增殖和凋亡。这些研究主要集中在细胞增殖和凋亡等基本功能上，但值得注意的是，类固醇激素合成是更为关键的功能。Jing等（2018）发现，ESR2可能是TLs中CYP19A1表达的潜在调控因子。Zhang等（2024c）进一步发现，FDFT1基因在鸡TLs中促进胆固醇生物合成。因此，研究TLs中的胆固醇代谢和类固醇激素生物合成，将有助于更深入地理解其在卵泡发育中的生物学功能。

为了解决这一问题，本研究采用了高通量RNA测序技术，以刻画TLs在卵泡发育关键阶段的mRNA表达谱。同时，结合多维生物信息学分析方法，挖掘更多影响TLs功能的功能性基因。这些发现将为理解TLs调控机制以及提高鸡的产蛋性能提供理论基础。

在本研究中，样本采集采用了严格的流程以确保实验的可重复性。研究对象为12只同窝的江苏黄鸡，年龄为27周，处于产蛋高峰期。为了确定采样时间点，我们依据输卵管的生理状态，即卵的存在及其蛋壳硬度，来判断排卵后的时间。最终，我们选择了三只具有相似生理条件且输卵管内卵较为柔软的母鸡，以采集其在卵泡发育期间的TLs样本进行RNA测序。这一过程确保了样本的代表性和实验结果的可靠性。

根据质量数据和序列比对结果（见表S1和图S1），RNA测序数据的准确性和可靠性得到了验证，这与我们之前的研究（Shen等，2020）一致，并作为补充数据表S2提供。本研究中，来自9个TLs样本的转录组原始序列读数已存入NCBI的序列读数存档（SRA）数据库，项目编号为PRJNA670262。由于高丰度的基因相较于低丰度的基因更具研究价值（Cheng等，2025），我们重点分析了这些高丰度DEGs在不同卵泡发育阶段的表达模式和功能富集情况。

研究结果显示，TLs中高丰度的DEGs主要与胆固醇代谢和类固醇激素合成相关。在SYFT阶段，胆固醇代谢相关基因如NPC1、NR0B1和POR表现出较高的表达水平，这些基因的上调与细胞分化相关信号通路如Wnt和mTOR通路的激活密切相关。而在F6T阶段，参与类固醇激素合成的基因如STAR、CYP11A1和CYP19A1则显著上调，这表明在这一阶段，TLs的功能更多地转向类固醇激素的合成。此外，上调的DEGs还富集于多种代谢通路，如叶酸介导的一碳池和柠檬酸循环，这些通路可能为F6T阶段的胆固醇合成提供支持。在F1T阶段，虽然具体的基因表达模式尚未完全揭示，但可以推测其在类固醇生成和卵泡成熟中的作用可能更为复杂。

通过进一步分析，我们发现一些关键基因如CYP19A1、CYP17A1、POR、NPC1、VLDLR和NR0B1主要出现在特征图谱3和1中，这些图谱通过趋势分析揭示了显著的表达模式。这表明这些基因在TLs的发育过程中具有重要的调控作用，并可能参与不同阶段的生理变化。此外，主要的KEGG通路包括细胞周期、同源重组、代谢和运输，这些通路的富集情况为理解TLs在卵泡发育中的功能提供了新的视角。

本研究的发现表明，TLs在不同卵泡发育阶段的转录程序发生了显著变化。在小黄卵泡阶段，TLs主要参与胆固醇的运输，而在级卵泡阶段则转向胆固醇的合成和类固醇生成。这一转变可能反映了TLs在卵泡发育过程中的功能适应性，即从简单的胆固醇载体转变为活跃的类固醇生成细胞。这种功能转变对于维持卵泡的正常发育和提高产蛋性能具有重要意义。

此外，本研究还揭示了TLs在卵泡发育中的分子机制。例如，CYP19A1基因在F6T阶段的高表达可能与其在类固醇激素合成中的关键作用有关。而NR0B1和POR基因在SYFT阶段的上调则可能与卵泡的初始发育和细胞分化相关。这些基因的表达变化可能通过调控关键代谢通路，如胆固醇合成和类固醇生成，从而影响卵泡的发育进程。同时，VLDLR和MSMO1等基因的表达模式也提示了TLs在胆固醇摄取和利用方面的潜在机制。

研究结果还表明，TLs在卵泡发育中的功能不仅限于类固醇激素的合成，还涉及更广泛的代谢和信号传导过程。例如，上调的DEGs可能通过激活一碳池和柠檬酸循环，为胆固醇合成提供必要的前体物质。而Wnt和mTOR信号通路的富集则可能提示TLs在细胞分化和增殖方面的调控作用。这些发现不仅有助于理解TLs在卵泡发育中的具体功能，还可能为未来的研究提供新的方向，例如探索这些基因在不同禽类中的表达差异，以及它们在卵泡发育调控中的协同作用。

本研究还强调了TLs在类固醇激素合成中的独特作用。与哺乳动物不同，鸟类的TLs在类固醇生成过程中直接负责雌二醇的合成，这可能与它们独特的生殖机制有关。因此，深入研究TLs中的类固醇激素合成相关基因，不仅有助于揭示其在卵泡发育中的作用，还可能为提高家禽的产蛋性能提供新的策略。例如，通过调控这些关键基因的表达，可能能够增强TLs的类固醇生成能力，从而促进卵泡的正常发育和排卵。

此外，本研究还为未来的研究提供了重要的理论基础。通过对TLs转录组的系统分析，我们不仅揭示了其在不同发育阶段的基因表达变化，还发现了这些变化背后的生物学意义。这些结果可能为家禽生殖调控的研究提供新的视角，并为基因工程和分子育种技术的应用奠定基础。例如，通过基因编辑或转基因技术，可能能够优化TLs的类固醇生成能力，从而提高鸡的产蛋性能。

本研究的结论还表明，TLs的转录程序在卵泡发育的不同阶段发生了显著的改变。这种改变不仅体现在基因的表达水平上，还可能影响整个卵泡的发育进程。因此，理解这些转录变化的机制，对于揭示卵泡发育的调控网络具有重要意义。同时，这些发现也为进一步研究TLs与其他细胞类型之间的相互作用提供了可能的线索。

综上所述，本研究通过转录组分析，揭示了TLs在不同卵泡发育阶段的基因表达模式及其功能富集情况。研究结果不仅有助于理解TLs在卵泡发育中的作用，还可能为提高鸡的产蛋性能提供新的思路和方法。这些发现将为家禽繁殖生物学的研究提供重要的理论支持，并为相关育种和生产实践提供科学依据。