ARDS患者中性粒细胞迁移小体相关基因机制的整合单细胞与转录分析

《Computational Biology and Chemistry》：Integrated Single-cell and Transcriptional analysis of Neutrophil Migrasome-associated Gene Mechanisms in ARDS

中性粒细胞迁移小体相关基因在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中的分子机制研究。通过单细胞转录组学分析结合GSEA、GSVA及机器学习方法，鉴定出COMT、PTPRC、RPAP2等关键基因，揭示其通过NF-κB、JAK-STAT等信号通路调控炎症反应及免疫细胞浸润。构建非编码RNA调控网络并预测60余种潜在药物靶点。

　　急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的临床综合征，其特征是肺部迅速受损并伴随严重的低氧血症。ARDS常出现在肺炎、误吸或系统性损伤如脓毒症和创伤患者的病情发展中。脓毒症是ARDS最常见的诱因之一，而其发病机制复杂，涉及多种炎症反应和免疫细胞的活动。尽管近年来对ARDS的管理和研究取得了进展，但该疾病的死亡率依然居高不下，尤其是在28天内死亡率为34.8%，整体住院死亡率为40.0%。这表明，开发更有效的治疗策略仍然是一个紧迫的任务。

在ARDS的发展过程中，中性粒细胞扮演了关键角色。这些免疫细胞能够迅速迁移至炎症部位，参与清除感染和组织修复。然而，中性粒细胞的迁移不仅仅是简单的细胞移动，还涉及多种信号通路和细胞器的相互作用。近年来，研究发现中性粒细胞来源的迁移动物（migrasomes）在细胞迁移和炎症反应中起着重要作用。迁移动物是一种特殊的细胞器，它在细胞迁移过程中形成，并通过选择性地分拣细胞成分来调节细胞间通信。在高度迁移的细胞如中性粒细胞中，迁移动物尤其重要。因此，理解中性粒细胞与迁移动物之间的关系不仅有助于揭示ARDS的发病机制，还可能为新的治疗策略提供线索。

目前，针对ARDS的有效药物治疗手段仍然有限，主要依赖于机械通气等支持性治疗。一些研究尝试通过靶向炎症相关的通路，如补体系统和细胞因子信号传导通路，寻找更好的治疗方案。此外，关于天然化合物和小分子药物调整免疫系统的研究正在进行中，一些药物在早期试验中表现出潜力。然而，由于ARDS的复杂性，开发靶向治疗仍然面临挑战。因此，深入研究其分子机制变得尤为重要。

为了探索中性粒细胞迁移动物相关基因在ARDS中的分子机制，本研究采用了单细胞测序技术和转录组学分析相结合的方法。通过从基因表达数据库GEO中下载ARDS的单细胞转录组数据，并基于单样本基因集富集分析（ssGSEA）方法计算迁移动物的单细胞比例，我们成功识别出1,268个与中性粒细胞迁移动物相关的差异表达基因。为了进一步筛选出重要的基因，我们结合了LASSO和SVM-RFE模型，最终确定了COMT、PTPRC和RPAP2等关键基因。

为了全面理解这些基因的分子机制，我们运用了多种生物信息学工具，包括功能富集分析、细胞通信分析（通过CellCall工具）、GSEA和GSVA分析、免疫浸润分析、基序分析、非编码RNA分析以及药物预测。这些分析不仅揭示了关键基因所参与的生物学过程和信号通路，还探讨了它们在免疫细胞浸润中的作用。此外，我们还验证了关键基因在单细胞水平上的表达，并研究了它们与迁移相关基因的协同表达情况，以及它们在中性粒细胞分化过程中的伪时间轨迹变化。这些基因被发现与多个通路和免疫细胞浸润有关，它们可能通过影响中性粒细胞的迁移和ARDS的发展而发挥作用。

我们的研究结果表明，中性粒细胞迁移动物相关的机制与ARDS的进展密切相关，所发现的参数，包括COMT、PTPRC和RPAP2等基因，可能是未来治疗ARDS的潜在靶点。这些基因的识别和功能分析为深入理解ARDS的分子机制提供了新的视角，并为开发新的治疗策略奠定了基础。

通过使用药物基因相互作用数据库（DGIdb），我们预测了针对COMT和PTPRC的潜在药物。例如，针对COMT的药物包括Entacapone、Hydrocodone和Trimipramine，而针对PTPRC的药物包括Estradiol Valerate、Epoetin alfa和Alendronate sodium。这些药物在ARDS中的作用可能因具体的情境和剂量而异，因此需要进一步的研究来明确它们在ARDS治疗中的具体作用。此外，我们还发现一些药物可能对ARDS产生负面影响，例如中枢神经系统抑制剂如Hydrocodone和Remifentanil，它们可能通过影响呼吸驱动和增加误吸风险而加重ARDS的病情。因此，在治疗过程中需要谨慎使用这些药物。

本研究的局限性在于所使用的GSE151263数据集仅包含女性样本，这可能限制了性别的普遍适用性。然而，这种同质性有助于在发现队列中减少性别相关的干扰。尽管如此，相对较小的样本量仍可能影响研究结果的外部有效性，因此需要更大的、多中心的队列来验证我们的发现。此外，我们的分析包括了两个来自不同患者队列的数据集，尽管这两个数据集主要代表欧洲血统的群体，从而减少了群体分层的影响，但不同队列之间的临床操作和患者特征的差异可能引入一定的变异性。为了减少技术偏倚，我们采用了已有的批次效应校正方法。虽然Harmony被用于校正技术批次效应，但独立测序运行之间的残余变异仍不能完全排除。最后，我们的研究结果主要基于计算机模拟分析，因此需要通过体外细胞实验和体内动物模型进一步验证COMT、PTPRC和RPAP2在迁移动物生物学和ARDS发病机制中的功能。为了全面理解疾病机制，纵向单细胞测序，以监测ARDS不同阶段的迁移动物相关特征，以及与蛋白质组学和代谢组学分析相结合，是至关重要的。我们计划在实验室中进行更大规模的体外和体内研究，以进一步验证我们的发现。此外，本研究中提出的药物预测还需要经过严格的临床前疗效和安全性评估，才能考虑临床应用。

本研究的结论表明，中性粒细胞迁移动物相关的基因网络，通过关键调控通路和非编码RNA的调控，可能成为治疗ARDS的潜在靶点。通过整合单细胞和转录组数据的深入分析，我们揭示了中性粒细胞迁移动物在ARDS中的分子特征。这使得我们能够识别出一组可能与中性粒细胞迁移动物相关的差异表达基因。通过功能富集分析，我们发现了这些基因相关的通路，而LASSO和SVM模型则帮助我们确定了与免疫细胞浸润和多个信号通路相关的特定基因，这些结果由GSVA和GSEA分析支持。此外，我们还探讨了这些关键基因与非编码RNA之间的关系，并分析了它们在不同阶段的表达情况。这些数据为开发新的ARDS治疗方法提供了重要的线索，并为未来的研究方向提供了指导。