在沼气浆料应用中降低氮含量有助于减轻土壤中的抗生素抗性基因

《Emerging Contaminants》：Low nitrogen in biogas slurry application mitigates antibiotic resistance genes in soil

农业土壤施用不同氮含量的生物气污泥（BS）对抗生素抗性基因（ARGs）的影响及机制分析。研究发现，低氮（0-120 kg N/ha）BS处理下土壤ARGs无显著变化，中高氮（180 kg N/ha）处理时ARGs和细菌丰度达到峰值，而高氮（240 kg N/ha）因土壤饱和和厌氧环境导致ARGs减少。结构方程模型表明NH4+是直接影响ARGs分布的关键因素。研究结果为精准施用BS和降低耐药基因扩散提供了理论依据。

　　在农业土壤中，使用沼气污泥（Biogas Slurry, BS）已被广泛认为是抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARGs）富集的热点区域。BS的施用显著提升了土壤中ARGs的水平，但目前对于BS中不同氮含量对ARGs分布模式的影响机制尚缺乏深入理解。本研究旨在通过Illumina测序和高通量定量PCR（HT qPCR）技术，探讨在不同BS施用量下ARGs的变化情况以及BS施用量与ARGs模式之间的潜在机制。研究结果表明，在低氮含量的BS施用条件下（0-120 kg N ha?1），ARGs的丰度并未发生显著变化，而在高氮含量的BS施用条件下（180 kg N ha?1），ARGs的丰度和细菌丰度显著增加，并且细菌网络中出现了明显的关联性。然而，当BS施用量达到240 kg N ha?1，土壤处于饱和状态时，ARGs的丰度因细菌数量减少而下降。结构方程模型（SEM）分析显示，土壤中NH??-N的含量是直接影响ARGs表征的关键因素。综上所述，低氮含量的BS在一定程度上抑制了ARGs的增加，而高氮含量的BS则通过引入氮素直接提升了ARGs的丰度。在厌氧环境中，BS的消毒效应在高施用量下发挥了重要作用，从而减少了ARGs的水平。这些发现有助于更深入地理解不同氮含量BS对土壤ARGs的影响，对精准施用BS和实现其高价值利用具有重要的环境意义。

本研究探讨了BS在不同氮含量条件下对土壤中ARGs的影响。BS是一种通过动物粪便厌氧消化产生的有机肥，其不仅能够有效去除有害物质如虫卵和病原体，还能释放出氮、磷等营养元素，成为一种比化学肥料更优质的替代品。此外，BS还具有一定的消毒作用，能够抑制土壤中的病害，如根结线虫和镰刀菌萎蔫病等。然而，BS的施用也可能带来ARGs的富集问题，特别是在长期施用的情况下，可能会促进ARGs的传播。因此，如何在提高土壤肥力的同时减少ARGs的扩散，是当前研究的重点。

为了评估BS施用量对ARGs的影响，本研究在不同氮含量下设置了五种BS施用处理，分别是不施用BS的对照组（S0）、60 kg N ha?1（S60）、120 kg N ha?1（S120）、180 kg N ha?1（S180）和240 kg N ha?1（S240）。实验设计基于BS的氮含量和土壤的氮需求进行，每个处理组的BS施用量分别为0.66 m3、1.32 m3、1.99 m3、2.65 m3和3.30 m3。BS的施用分为两次，第一次作为基肥施用在种植前，第二次作为追肥施用在种植后一个月。施用BS后，通过灌溉进行稀释，以达到均匀施用的目的。实验中采集了不同深度的土壤样本（0-30 cm、30-60 cm、60-90 cm），并进行了一系列物理和化学性质的测定，包括pH值、电导率（EC）、有机质（OM）、总碳（TC）、总氮（TN）、NH??-N、硝酸盐（NO??-N）和有效磷（AP）等指标。此外，还提取了土壤中的DNA，利用HT qPCR和Illumina测序技术对ARGs和移动遗传元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）进行了分析。

研究结果表明，在低氮含量的BS施用条件下（S0至S120），ARGs的丰度没有显著变化，但随着BS施用量的增加，土壤中的细菌网络开始发生变化。在S180处理中，ARGs和MGEs的丰度达到峰值，同时土壤中的细菌数量也显著增加。然而，在S240处理中，土壤处于饱和状态，细菌数量减少，导致ARGs的丰度下降。进一步的分析表明，NH??-N的含量是影响ARGs变化的直接驱动因素，而其他土壤性质如EC、NO??-N和TC则通过间接机制影响ARGs的丰度。此外，细菌的ACE丰富度（Alpha Diversity Index）和细菌丰度对ARGs的分布模式也有显著影响。具体而言，细菌ACE丰富度与ARGs之间存在间接的负相关关系，而细菌丰度则与ARGs存在直接的负相关关系，但总体上对ARGs的影响是正向的。这表明，在低氮含量的BS施用条件下，细菌的减少可能限制了ARGs的传播，而在高氮含量的条件下，丰富的营养促进了细菌的生长，从而增加了ARGs的丰度。

在不同BS处理下，ARGs的相对丰度呈现出不同的变化趋势。例如，在S180处理中，ARGs的相对丰度最高，达到0.65至0.70 copies，而在S0和S60处理中，ARGs的相对丰度较低。同时，BS中检测到的ARGs和MGEs种类比土壤中多，说明BS本身携带了更多的ARGs和MGEs。此外，BS的施用还改变了土壤中的细菌群落结构，使得某些细菌成为ARGs的潜在宿主，从而影响ARGs的传播。在S180处理中，ARGs的相对丰度显著增加，同时细菌网络的复杂性也有所提高，表明BS的施用促进了ARGs在土壤中的扩散。而在S240处理中，虽然ARGs的相对丰度有所下降，但其与细菌的相互作用仍然存在，说明BS的消毒效应可能不足以完全抑制ARGs的传播。

在讨论部分，研究进一步探讨了BS施用对ARGs变化的影响机制。研究发现，在低氮含量的BS施用条件下，ARGs的丰度并未显著增加，这可能是由于氮的限制抑制了微生物的生长，从而减少了ARGs的传播。而在高氮含量的BS施用条件下，土壤中的细菌丰度显著增加，促进了ARGs的富集。此外，BS的施用还改变了土壤中的微生物群落结构，使得某些细菌成为ARGs的潜在宿主，从而影响ARGs的传播。在S240处理中，由于土壤处于饱和状态，BS的施用导致了NH??-N的积累，这种高浓度的NH??-N对微生物具有毒性作用，可能抑制了细菌的生长，从而减少了ARGs的传播。这一现象与SEM分析结果一致，表明NH??-N是影响ARGs变化的关键因素。

研究还指出，BS的施用对ARGs的影响可能与土壤的物理和化学性质密切相关。例如，土壤的pH值、EC、OM、TC等指标可能间接影响ARGs的丰度。此外，BS的施用还改变了土壤中的微生物群落结构，使得某些细菌成为ARGs的潜在宿主，从而影响ARGs的传播。因此，如何在保证土壤肥力的同时，减少ARGs的扩散，是当前研究的重要方向。

本研究的局限性在于，实验仅在一种土壤类型上进行，可能限制了结果的普适性。此外，研究仅在采收后进行，未能涵盖土壤抗性基因（Resistome）在不同季节的变化。因此，未来的研究需要在更广泛的土壤类型和不同季节条件下进行，以更全面地理解BS施用对ARGs的影响。同时，采用宏基因组学方法可以更精确地识别ARGs的潜在宿主，从而更深入地探讨ARGs的传播机制。此外，研究还应进一步探讨不同BS施用策略对ARGs丰度的影响，以提高研究结果的实用性和推广价值。