利用II型甲烷氧化菌（Methylocystis sp. NK4-5-1）通过油棕汁产生的沼气实现可持续的PHB（聚羟基丁酸酯）生产

《Environmental Technology & Innovation》：Sustainable PHB production by Type II methanotroph Methylocystis sp. NK4-5-1 utilizing oil palm sap-derived biogas

生物甲烷氧化菌PHB合成及特性研究。采用两步稀释法从日本沼泽淤泥中富集并分离出甲烷氧化菌Methylocystis sp. NK4-5-1，优化其合成聚-β-羟丁酸（PHB）的条件，发现该菌株在合成甲烷（30% v/v）中48小时PHB含量达29%±3.8%（w/w），而在棕榈树液（OPS）发酵产生的生物气中PHB含量为13.1%±3.8%（w/w）。通过1H NMR和DSC分析表明，生物气源PHB分子量（536 kDa）和熔点（176℃）显著优于合成甲气源（348 kDa，170-175℃），证实生物气中杂质可提升PHB热稳定性。研究为甲烷资源化及可持续生物塑料生产提供新菌种和工艺参数。

　　随着全球温室气体排放和塑料污染问题日益严重，开发可持续的解决方案成为当务之急。2023年，温室气体（GHG）排放量达到历史最高水平，达到53.0吉吨二氧化碳当量（Gt CO?eq），较2022年增加了1.9%（Crippa, 2024）。这些气体主要来源于化石燃料、农业、畜牧业、垃圾填埋场和工业活动，加剧了全球变暖、极端天气事件和生态系统破坏（Filonchyk et al., 2024）。其中，甲烷因其比二氧化碳高28倍的温室效应（IPCC, 2014），成为减缓气候变化的关键目标。塑料污染广泛使用且难以自然降解，其在海洋和陆地上的持久性导致生态破坏，并进一步加剧了温室气体排放，放大了气候变化的影响。这一事实催生了对可持续替代品，如可生物降解塑料的迫切需求（Sharma et al., 2023）。

聚羟基烷酸酯（PHAs）是一种天然的可生物降解聚酯，由多种微生物合成（Fukala and Ku?era, 2024）。它们结合了生物降解性和机械性能，与石化塑料相似（Mai et al., 2024）。PHAs根据单体链长被分为短链长度（scl-PHAs，3-5个碳原子）和中链长度（mcl-PHAs，6-14个碳原子）。scl-PHAs具有结晶性，适用于包装和生物医学应用，而mcl-PHAs则具有柔韧性，适合用于粘合剂和支架（Getino et al., 2024；Reddy et al., 2022）。聚羟基丁酸酯（PHB），作为最主要的PHAs，是由细菌和古菌合成的一种可生物降解聚合物，提供了生态友好的终期处理方式（Patel et al., 2024）。PHB的性能与聚丙烯相似，但在脆性方面更高，限制了其应用，除非进行改性（Moreira et al., 2021）。

为克服这些限制并增强可持续生产，研究重点转向了利用甲烷的甲烷氧化菌作为PHB的潜在生产者。这些细菌使用C1底物，如甲烷和甲醇，作为其唯一的碳和能量来源，生产各种生物产品，包括生物塑料、生物燃料、微生物蛋白和其他高价值化学品（G?sicka et al., 2021）。甲烷氧化菌根据其膜结构和甲醛同化途径被分为三种类型：I型、II型和X型。I型，如Methylococcus、Methylomonas和Methylobacter，具有束状囊泡膜，并使用核酮糖单磷酸（RuMP）途径。II型，如Methylosinus和Methylocystis，具有外围膜，并依赖于丝氨酸途径。X型，如Methylococcus capsulatus，使用两种途径（G?sicka et al., 2021；Higgins et al., 1981；Whittenbury and Wilkinson, 1970）。II型甲烷氧化菌在PHB合成中尤为重要，因为它们通过丝氨酸途径将甲烷转化为乙酰辅酶A（Nguyen et al., 2021；Pieja et al., 2011a）。早期研究表明，Methylocystis parvus中存在PHB颗粒，而Methylosinus trichosporium OB3b的PHB含量可达30%（w/w）（Whittenbury et al., 1970；Best and Higgins, 1981；Doronina et al., 2008）。多个属，包括Methylosinus、Methylocystis、Methylocapsa、Methylotuvimicrobium、Methylococcus、Methylobacterium和Methylocaldum，都是PHB的生产者（Delherbe et al., 2024；Karthikeyan et al., 2015；Patel et al., 2024）。

与I型菌株相比，II型菌株在甲烷富集环境中表现出更高的PHB合成能力。氮限制、铜缺乏、低pH值和稀释培养基已被证明能促进PHB的生产（Pieja et al., 2011a；Hyun et al., 2024）。例如，Methylocystis sp. GB 25在铵缺乏条件下积累了51.3%（w/w）的PHB（Wendlandt et al., 2001）。底物组成也影响所产聚合物的类型，甲烷有利于PHB的形成，而与丙酸或戊酸共喂养则会导致PHB-co-3HV共聚物的产生（Luangthongkam et al., 2019）。

鉴于其作为可持续PHB生产者的潜力，甲烷氧化菌正受到越来越多的研究关注。然而，高效的菌株分离和评估方法仍有限。特别是，需要简单的方法来识别高表现的甲烷氧化菌，并理解不同甲烷来源如何影响PHB的生物合成。为解决这些问题，本研究应用了两步稀释方法，从日本的环境样本中分离和筛选甲烷氧化菌。它们的PHB生产使用合成甲烷和由新鲜油棕汁（OPS）产生的生物气进行评估，并对结果进行比较，显示甲烷来源显著影响PHB产量和特性。

在实验中，通过两步稀释法对甲烷氧化菌进行富集和分离。首先，将停滞的泥水样本接种到含有30%（v/v）甲烷和21%（v/v）氧气的Choi培养基中，在30°C下摇床培养（110 rpm）2周以建立种子培养物。甲烷富集的环境有利于甲烷氧化菌的生长，同时抑制非甲烷氧化菌的生长。种子培养物随后经历了两次连续的富集步骤。第一次富集时，将种子培养物转移至新鲜的Choi培养基中，以较低的接种体积进行培养，再经历2周的相同条件。第二次富集时，将第一次富集的培养物以较高的接种体积转移至新鲜培养基中，并在相同条件下培养2周。这种逐步稀释方法选择性地富集了甲烷氧化菌，同时减少了非甲烷氧化菌的数量。经过两次甲烷富集后，微生物群落发生了显著变化（Fig. 1B）。细菌序列总数从32,486减少到29,620，表明甲烷氧化菌受到了强烈的筛选压力。

富集后的微生物群落由Methylophilaceae（42.3%）、Methylocystis（41.5%）和Methylococcaceae（2.1%）主导，形成了一个高度特化的甲烷代谢共生体。Methylophilaceae作为Methylophilales的成员，使用甲醇或甲胺作为碳源，但不能直接氧化甲烷（Doronina et al., 2014）。Methylocystis sp. NK4-5-1的高丰度表明它与Methylocystis形成共生关系，这种菌通过丝氨酸途径氧化甲烷（Hanson & Hanson, 1996）。这种甲烷氧化菌与非甲烷氧化微生物之间的协同作用促进了有益的生长，并调节了甲烷排放（Rani, 2021）。甲烷氧化菌产生中间产物和代谢副产物，这些可以作为非甲烷氧化微生物的碳源，而非甲烷氧化微生物则代谢有害的抑制性化合物，防止其积累并支持甲烷氧化菌在甲烷丰富的环境中的持续活动（Rani, 2021）。共生关系在甲烷氧化菌与其他物种之间很常见。例如，Methylosarcina氧化甲烷生成甲醛，进而驱动Hyphomicrobium的硝酸盐还原作用（Wu et al., 2024）；或者在与Bathymodiolus platifrons共生体的协同作用下，促进从甲烷中合成胆固醇（Takishita et al., 2017）。

Methylocystis sp. NK4-5-1在甲烷条件下形成了PHB颗粒，这证实了其分类在Methylocystis属内，该属已被证实能产生PHB。II型甲烷氧化菌通过丝氨酸途径合成PHAs，涉及由β-酮硫醇酶（PhaA）、乙酰乙酸辅酶A还原酶（PhaB）和PHAs合成酶（PhaC）编码的关键酶（Patel, 2024）。Methylocystis sp. NK4-5-1的PhaC基因已被确认和鉴定，可能在PHB聚合中起关键作用。

进一步验证甲烷氧化菌的身份，通过扩增颗粒甲烷单氧酶（pmoA）基因，该基因通过BLAST分析确定。通常使用A189和A682引物扩增pmoA和amoA基因，分别编码颗粒甲烷单氧酶（pMMO）和氨单氧酶（AMO）酶，作为识别甲烷氧化菌和氨氧化菌的分子标记，反映16S rRNA的系统发育（Bourne et al., 2001）。然而，本研究使用A189/mb661引物对Methylocystis sp. NK4-5-1进行扩增。反向引物mb661与A189特异性地针对pmoA，而不扩增amoA（Costello & Lidstrom, 1999）。PCR扩增得到了一个约508 bp的pmoA扩增子（Supplementary Data S4）。Methylocystis sp. NK4-5-1的pmoA基因序列显示出最高相似性（98.98%同源性和96%查询覆盖度）与II型甲烷氧化菌OTU_98（MK613991.1）。值得注意的是，NK4-5-1还显示出与已知的II型甲烷氧化菌Methylocystis iwaonis SD4（98.02%同源性，100%查询覆盖度；CP143314.1）和SS37A-Re（97.64%同源性，100%查询覆盖度；AP027142.1）的强序列相似性，表明其与这些菌的密切进化关系。此外，NK4-5-1显示出与几个未培养的甲烷氧化菌的高相似性，包括MD3-5KMM3（KT327480.1）、RsVc-05（AJ543420.1）、Rz90f-09（AJ543419.1）和Rr90a-01（AJ543421.1）。基于mb661引物区域的序列比对，NK4-5-1显示出与未培养菌和已知的Methylocystis iwaonis菌株的强系统发育关系，因为其具有高核苷酸同源性（Fig. 4）。然而，检测到显著的核苷酸变化，尤其是在mb661区域，甚至在Methylocystis iwaonis菌株SD4（CP143314.1）和SS37A-Re（AP027142.1）的多个pmoA基因位点。这些结果表明NK4-5-1与其他Methylocystis菌株存在差异。环境选择因素可能促进菌株特异性的进化适应或水平基因转移事件，改变引物结合区。显著的选择压力可能驱动pMMO的进化适应，因为甲烷氧化菌是复杂微生物群落中的主要生产者（Villada et al., 2019）。

NK4-5-1菌株是从停滞的泥水样本中分离出来的，而与其密切相关的菌株则来源于不同的栖息地，包括稻田、稻田土壤、废水、洪水稻田和高山泥炭地。这一观察结果突出了该细菌群的适应性和广泛的生态范围，尤其是在氧气水平低、有机物含量高的水生或半水生环境中。

本研究通过两步稀释法从停滞的泥水样本中分离和筛选甲烷氧化菌。81个菌落被获得，其中10个在紫外线下显示出高荧光。荧光菌落通过使用30%（w/v）甲烷作为碳源，并在110 rpm下培养72小时，筛选PHB生产。干细胞中的PHB含量从0.03%到10%不等。NK4-5-1菌株表现出最高的PHB积累，被选为进一步鉴定。

NK4-5-1菌株形成奶油白色、圆形的菌落，具有凸起的边缘、光滑的表面和完整的边缘。Gram染色确认NK4-5-1菌株为革兰氏阴性菌。在光学显微镜下，细胞形态为略微压缩的球形、椭圆形或短杆状（Fig. 2A）。透射电镜（TEM）显示NK4-5-1菌株的细胞为球杆菌状，宽度约为0.8微米，长度约为1.3微米，并在甲烷条件下含有PHB颗粒（Fig. 2B）。TEM分析显示NK4-5-1菌株的细胞具有细胞质内的膜系统。在细胞质中发现的叠层膜结构是II型甲烷氧化菌的特征，通常包含囊泡或同心叠层膜系统。I型甲烷氧化菌在整个细胞中具有盘状囊泡，而II型甲烷氧化菌则具有外围排列的细胞质膜（Hanson and Hanson, 1996）。

进一步验证甲烷氧化菌的身份，通过扩增颗粒甲烷单氧酶（pmoA）基因，该基因通过BLAST分析确定。通常使用A189和A682引物扩增pmoA和amoA基因，分别编码颗粒甲烷单氧酶（pMMO）和氨单氧酶（AMO）酶，作为识别甲烷氧化菌和氨氧化菌的分子标记，反映16S rRNA的系统发育（Bourne et al., 2001）。然而，本研究使用A189/mb661引物对NK4-5-1菌株进行扩增。反向引物mb661与A189特异性地针对pmoA，而不扩增amoA（Costello & Lidstrom, 1999）。PCR扩增得到了一个约508 bp的pmoA扩增子（Supplementary Data S4）。NK4-5-1菌株的pmoA基因序列显示出与其它PHB生产菌Methylocystis spp.的高序列保守性。与Methylocystis iwaonis菌株SS37A-Re（96.06%同源性；AP027142.1）和SD4（95.64%同源性；CP143314.1）的pmoA序列高度相似，两者都有100%的查询覆盖度。此外，还观察到与其它物种，如Methylocystis sp. MJC1（CP107558.1）、Methylocystis sp. M（HQ860425.1）和Methylocystis parvus菌株BRCS2（CP044331.1）和OBBP（CP092968.1）的序列同源性范围为91%至97%。这种分类进一步通过使用邻接连接法构建的系统发育树（Fig. 5）得到支持。

通过16S rRNA、pmoA和phaC基因分析，该菌株被鉴定为Methylocystis sp. NK4-5-1。本研究发现，NK4-5-1菌株的phaC基因属于I类PHAs合成酶。该基因序列与Methylocystis spp.的I类phaC基因序列紧密聚类，形成一个与II类（Pseudomonas sp.）、III类（Methylobacterium sp.）和IV类（Bacillus megaterium）序列不同的明确分支。这些结果表明，NK4-5-1菌株的phaC基因属于I类PHAs合成酶，表明该菌株可能通过丝氨酸途径的甲醛同化作用，产生scl-PHAs，这有助于PHAs的生物合成（Patel et al., 2021；Rehm, 2003）。

为了优化NK4-5-1菌株的生长条件和从合成甲烷中PHB的生产，本研究调整了培养基类型、pH值和温度。首先，使用Choi和NMS培养基培养NK4-5-1菌株。如图6A所示，两种培养基在前24小时内支持相似的生长，随后在48小时后出现显著差异（p < 0.05）。使用Choi培养基的菌株表现出更高的生长，达到OD600值为0.40，这大约是使用NMS培养基的菌株的两倍。两种培养基中氮源的差异解释了更好的生长结果。Choi培养基使用硫酸铵作为氮源，而NMS培养基使用硝酸钾。在测试的氮源中，硫酸铵比硝酸钾更有利于NK4-5-1菌株的生长，这与先前报告一致，即Methylocystis菌株在铵上生长良好，并表现出更高的耐受性（Nyerges et al., 2010；Tays et al., 2018）。尽管铵和亚硝酸盐都能显著影响甲烷氧化菌的生长，但它们的影响取决于每种菌株对营养物的同化能力和对抑制性化合物的耐受性，即使在相同的甲烷氧化菌类型中也是如此（Nyerges et al., 2010）。然而，一些研究报道某些Methylocystis菌株，包括M. hirsute（G?sicka et al., 2024；Kulkarni et al., 2022），表现出对硝酸盐的偏好。这种偏好可能源于其脱氮活性、对亚硝酸盐的更高耐受性，或由于铵的结构与甲烷相似，导致其对甲烷单氧酶活性位点的竞争（Bédard and Knowles, 1989；G?sicka et al., 2024）。

NK4-5-1菌株的生长条件和PHB产量受初始pH值影响。如图6B所示，使用Choi培养基的菌株在初始pH值为5.5、6.0、6.5和7.0时表现出生长，其中在pH值为6.0和6.5时获得最高的生物量，随后是pH值为7.0。pH值为5.5时的细胞密度在48小时后才被检测到。相比之下，整个培养期间在pH值为8.0时未检测到生长，表明碱性条件强烈抑制NK4-5-1菌株的生长。在pH值为6.0和6.5时，生长趋势在72小时内是相似的。随后，pH值为6.0时的细胞密度下降，而pH值为6.5时的生长则继续。同样，pH值为7.0时的生长在72小时后也下降。在pH值为5.5时，生长起初缓慢，生物量在整个早期阶段保持较低，但随后继续增加，最终达到与pH值为6.5时相似的生物量。基于不同初始pH条件下的生长曲线，确定pH值为6.5是培养NK4-5-1菌株的最佳初始pH。这种条件支持了整个培养期间的快速早期生长和持续的生物量积累，而不会出现其他pH值下观察到的生长减少。有趣的是，尽管pH值为5.5时的生长起初缓慢，但最终的生物量达到与pH值为6.5时相似的水平。这些结果与Pérez等人的报告一致，他们发现pH值为7支持高生物量生产，并具有较短的滞后期（Pérez et al., 2024）。相比之下，尽管pH值为5.5时的最终生物量与pH值为7时相似，但观察到较长的滞后期，这可能是由于Methylocystis菌株适应更酸性条件所需的适应过程。甲烷氧化菌可以在广泛的pH范围内生长（Yao et al., 2023），许多菌株在中性pH条件下表现出最佳生长。据报道，Methylocystis sp. H2s在pH值6.0至6.5之间生长最佳（Belova et al., 2011），而Methylocystis sp. SB2在pH值6.8时表现出最佳生长（Im et al., 2011）。然而，最近的研究发现某些甲烷氧化菌能够在强酸或强碱环境中生长（Yao et al., 2023）。值得注意的是，Methylacidiphilum菌株在pH值2.0至3.0之间生长最佳（Schmitz et al., 2021）。

NK4-5-1菌株在不同温度下的生物量生产被评估为25、30和35°C。如图6C所示，所有测试温度下的生物量随时间增加，但30°C时在72小时后出现下降。在测试的条件下，25°C时获得最高的生物量，其次是30°C和35°C。这些结果表明，NK4-5-1菌株在25°C时表现出最佳生长。许多属于Methylocystis属和其他相关属的菌株被鉴定为中温甲烷氧化菌，其最佳生长温度在23-25°C和31-34°C之间（Kevbrina et al., 2001）。甲烷氧化菌的最佳生长温度似乎受到其原始栖息地环境条件的影响。来自寒冷或水丰富环境的菌株通常表现出中等的温度偏好。例如，来自森林土壤的Methylocystis silviterrae sp. nov. FST和来自地下水的Methylocystis hirsuta CSC1?，其最佳生长温度在25至30°C之间。同样，来自湿地土壤的Methylocystis rosea SV97?表现出最佳生长温度约为27°C（Tikhonova et al., 2021）。然而，一些来自寒冷或湿润环境的甲烷氧化菌可以在广泛的温度范围内生长，其最佳生长温度在中等水平。这种模式表明了一定程度的热适应性，使它们能够在不同的环境条件下生存（Zhu et al., 2024）。

氮源的可用性强烈调节甲烷氧化菌的PHB生物合成。虽然过量的氮源支持生物量增长并抑制PHB积累，但氮源限制通常增强PHB合成（Zhou et al., 2022）。通过使用Choi培养基（pH 6.5，25°C）在不同浓度的（NH?）?SO?作为氮源的条件下培养NK4-5-1菌株，以研究氮源可用性对PHB生产的影响。如图6D所示，当（NH?）?SO?浓度为0.21、0.10和0.05 g N/L时，细胞密度没有显著差异（p < 0.05），表明中度氮限制不会影响生长。相比之下，PHB积累随着氮源可用性的减少而显著增加。在0.21 g N/L时，PHB含量在4%至22%之间，而在0.10 g N/L时增加到11%至41%。进一步减少到0.05 g N/L时，PHB积累略微减少到11%至23%，但仍超过0.21 g N/L时的水平。因此，PHB积累的最佳氮浓度为0.10 g N/L（NH?）?SO?。这些结果与先前对Methylocystis parvus OBBP的发现一致，其中氮限制增强了PHB合成，并且观察到Methylocystis sp.在培养基中氮水平低于10 mg N/L时开始储存PHB（Pérez et al., 2024）。综上所述，数据证实了氮限制对NK4-5-1菌株PHB积累的促进作用，这与其作为细胞内碳和能量储备支持营养缺乏时的生理作用一致。

为了确认NK4-5-1菌株从甲烷中合成PHB，使用30%（v/v）的合成甲烷和含有21%（v/v）氧气的空气，在Choi培养基中培养，其中氮源为0.1 g N/L的（NH?）?SO?，pH值为6.5，温度为25°C，摇床速度为180 rpm。图7显示了在最佳条件下，NK4-5-1菌株从合成甲烷中生长和PHB积累的情况。结果表明，生物量生产和PHB积累在培养期间同时增加，达到48小时时的最高值，生物量为0.54 ± 0.03，PHB含量为29% ± 3.8%（w/w）。随后，生物量似乎在72小时后进入稳定期。这种生长趋势与Methylocystis sp. MJC1的观察结果一致，其中细胞生长和PHB含量随培养时间增加，并在约72小时后进入稳定期（Lee et al., 2023）。

在达到最大生物量和PHB积累后，NK4-5-1菌株进入稳定期，随后生物量和PHB含量逐渐减少。在此培养过程中，甲烷（作为碳源）和氮源仅在培养开始时供应。随着培养的进行，这些营养物质的耗尽与生长停滞和随后的细胞质量和PHB含量减少相吻合。观察到的PHB含量减少表明，储存的聚合物在后期培养阶段被细胞内使用（Handrick et al., 2000；Pieja et al., 2011b；Serafim et al., 2004）。

本研究采用两阶段发酵系统对新鲜OPS进行生物气化。第一阶段通过原生微生物进行好氧酸化，产生酸化的OPS（预发酵OPS）。第二阶段使用牛粪作为接种物，进行厌氧发酵，以促进预发酵OPS的生物气生产。该过程如Supplementary Data S6所示。在新鲜OPS中检测到柠檬酸和琥珀酸，但乳酸、乙酸和丁酸未在新鲜OPS样本中发现（Supplementary Data S7）。在7天的自然发酵后，乙酸和乳酸被鉴定为主要有机酸。琥珀酸和丁酸也在较低浓度下检测到，而柠檬酸未被检测到。在油棕树中已报告微生物多样性，包括细菌、酵母和霉菌（Faparusi, 1974）。在自然棕榈汁收集过程中，已鉴定出Lactobacillaceae、Leuconostocaceae和Acetobacteraceae科的微生物群落为优势微生物群（Djeni et al., 2022）。在汁液发酵过程中，乳酸菌（LAB）和醋酸菌（AAB）使用棕榈汁中自然存在的糖作为碳源。LAB将这些糖转化为乳酸，而AAB将糖或乙醇氧化为醋酸。这种微生物活动导致有机酸的积累，从而在发酵过程中使汁液酸化（Santiago-Urbina et al., 2013）。这一观察结果得到了最近研究的支持，即OPS的自然发酵导致有机酸的高浓度积累。

值得注意的是，在21天的厌氧发酵预发酵OPS与牛粪后，未检测到有机酸，而生物气生产继续增加。生物气生产，主要为甲烷，显示出在11小时时呈指数增长，随后呈温和增长，持续到发酵结束（Supplementary Data S8）。如Supplementary Data S9所示，甲烷占生物气的70%，其次是CO?和氮气（N?）。特别是，牛粪，尤其是奶牛粪，被认为是温室气体（GHG）的主要来源，其中主要为CH?（Cárdenas et al., 2021）。因此，许多研究使用牛粪作为生物气生产的启动物（Arshad et al., 2022；Kushwaha et al., 2024；Shaibur et al., 2021）。牛粪中的多样化微生物群落通过四个阶段（水解、酸化、乙酸化和甲烷化）驱动生物气的产生。在厌氧消化过程中，复杂的生物质通过水解被分解为更简单的化合物。在酸化阶段，这些化合物被转化为挥发性脂肪酸、醇类、氢气和CO?。这些中间产物在乙酸化阶段进一步转化为乙酸、氢气和CO?，然后被甲烷化细菌用于生产甲烷（Detman et al., 2021；Meegoda et al., 2018）。通常，生物气主要由CH?（55%-70%）、CO?（35%-40%）、N?（0%-3%）、O?（0%-1%）和H?S（0%-1%）组成（Calbry-Muzyka et al., 2022）。本研究成功地使用由OPS微生物发酵产生的有机酸作为PHB合成的碳源，通过Methylocystis sp. NK4-5-1进行生物气的利用。

图8显示了Methylocystis sp. NK4-5-1在生物气发酵过程中对甲烷的消耗、细胞生长和PHB积累。在整个过程中，生物气被间歇性供应以维持甲烷浓度约为5%。在前24小时内，甲烷消耗相对缓慢，每小时约0.02%。在24至48小时内，CH?消耗率增加到每小时约0.12%。在72小时后，生物气被间歇性供应以维持甲烷浓度约为5%和约1%的N?。在这些供应后，甲烷消耗率持续在每小时0.14%至0.16%之间，细胞质量继续积累。同时，细胞质量在整个发酵过程中稳定增加。在10天的发酵结束时，PHB积累在10%至17%（w/w）之间，平均含量为13.1% ± 3.8%（w/w）。在生物气喂养的批次发酵中，Methylocystis sp. NK4-5-1未表现出生长抑制，细胞质量随时间继续增加。相比之下，使用合成甲烷培养的菌株在48小时后表现出生物质量减少，这是由于氧气和甲烷气体不足（Fig. 5）。这些结果表明，生物气喂养的批次发酵，甲烷维持在5%和N?在1%，有效支持了Methylocystis sp. NK4-5-1的生长，但PHB积累低于使用合成甲烷的培养物。这些结果与I型和II型甲烷氧化菌在低生物气浓度下的生长模式一致，显示出持续的细胞质量积累，没有生长抑制（Hyun et al., 2024）。使用生物气比纯甲烷更具挑战性，因为其复杂组成包括各种气体和可能对细胞有毒或抑制的杂质，如硫化氢（H?S）（Vu et al., 2022）。

PHB积累在生物气发酵中表现出从10%到17.3%（w/w）的范围（Fig. 8），这显著低于使用合成CH?的29%（w/w）。这一结果与Hyun等人（2024）的发现不同，他们报告说在生物气培养下，Methylocystis sp. OK1表现出增强的生物量和PHB生产。生物气中的CH?-CO?混合物可以为甲烷氧化菌提供辅助碳源和额外的还原力，这可能刺激PHB的合成（Pham et al., 2024）。在本研究中，甲烷通过生物气喂养持续供应，氮源按比例添加。同时供应氮源并未增强NK4-5-1菌株的PHB积累，尽管在连续供应两种底物的情况下，生物质量继续增加，这与先前报告一致，即连续供应氮源有利于生长，但不利于PHB储存（Rodríguez et al., 2022）。

这些结果表明，OPS衍生的生物气可以作为PHB生产的底物，但优化的喂养组成、气体比例和培养基配方对于最大化PHB产量至关重要。与合成甲烷相比，较低的PHB产量可能反映了原始生物气中存在抑制性化合物，包括H?S、氨和挥发性有机物，这些化合物会随着原料和工艺条件的变化而变化（Werkneh, 2022）。事实上，生长和PHB生产在甲烷氧化菌中，特别是I型Methylomonas sp. DH-1和II型Methylocystis sp. MJC1，在1.5% H?S浓度下受到抑制（Hyun et al., 2024）。菌株对这些杂质的耐受性可能解释了PHB生产性的差异。此外，甲烷喂养策略可能在其中起关键作用，因为一次性甲烷添加在整个过程中维持了较高的甲烷水平，而连续生物气喂养导致任何时间的CH?浓度较低，这可能限制碳可用性并延迟PHB积累。这种效应对于II型甲烷氧化菌尤为重要，如Methylocystis sp.，它们在较高的甲烷浓度下表现出最佳的生物量和PHB产量，与I型菌株相比（Feroskhan and Ismail, 2016；Hyun et al., 2024）。使用生物气比纯甲烷更具挑战性，因为其复杂组成包括各种气体和潜在的有毒或抑制性杂质，如硫化氢（H?S）（Vu et al., 2022）。

为了优化生物气喂养批次发酵中的条件，使用不同的碳源和氮源组合，如Methylocystis sp. NK4-5-1在生物气喂养批次发酵中表现出的PHB积累。如图8所示，生物气喂养批次发酵中，Methylocystis sp. NK4-5-1的甲烷消耗、细胞生长和PHB积累情况。在整个过程中，生物气被间歇性供应以维持甲烷浓度约为5%。在前24小时内，甲烷消耗相对缓慢，每小时约0.02%。在24至48小时内，CH?消耗率增加到每小时约0.12%。在72小时后，生物气被供应在144、168、192和216小时，以维持甲烷浓度约为5%和N?约为1%。在这些供应后，甲烷消耗率持续在每小时0.14%至0.16%之间，细胞质量继续积累。同时，细胞质量在整个发酵过程中稳定增加。在10天的发酵结束时，PHB积累在10%至17%（w/w）之间，平均含量为13.1% ± 3.8%（w/w）。在生物气喂养批次发酵中，Methylocystis sp. NK4-5-1未表现出生长抑制，细胞质量随时间继续增加。相比之下，使用合成甲烷培养的菌株在48小时后表现出生物质量减少，因为氧气和甲烷气体不足（Fig. 5）。这些结果表明，生物气喂养批次发酵，维持甲烷在5%和N?在1%，有效支持了Methylocystis sp. NK4-5-1的生长，但PHB积累低于使用合成甲烷的培养物。这些结果与I型和II型甲烷氧化菌在低生物气浓度下的生长模式一致，显示出持续的细胞质量积累，没有生长抑制（