基于mRNA和gDNA的多重微滴式数字PCR检测方法在NPM1突变急性髓系白血病患者中的验证研究

《Clinical Chemistry》：Validation of a Multiplex mRNA- and gDNA-Based Droplet Digital PCR Assay in Acute Myeloid Leukemia Patients with an NPM1 Mutation

本研究针对急性髓系白血病（AML）中NPM1突变检测的临床需求，开发了一种可同时检测10种不同NPM1突变mRNA转录本和基因组DNA（gDNA）变异等位基因频率（VAF）的多重微滴式数字PCR（ddPCR）方法。该方法采用通用探针和反向引物配合10种突变特异性正向引物的创新设计，显示可忽略的假阳性信号和高检测精度，gDNA检测限达0.007% VAF，mRNA检测限达0.02%。研究证实gDNA检测能更准确反映白血病肿瘤负荷，为AML微小残留病（MRD）监测提供了重要技术突破。

　　

在血液肿瘤领域，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）一直是最具挑战性的恶性疾病之一。这种疾病的特征在于骨髓中未成熟髓系细胞的异常增殖，导致正常造血功能受到抑制。在AML的众多遗传学异常中，核磷蛋白1（nucleophosmin 1, NPM1）基因突变占据着特殊地位，约占成人AML病例的35%，在核型正常的AML中更是高达50%-60%。自2016年起，伴有NPM1突变的AML已被世界卫生组织列为独立的疾病实体。

NPM1基因编码的蛋白质在核糖体颗粒运输、核糖体生物合成和应激反应等多种生物学过程中发挥关键作用。该基因最常见的突变形式是在外显子11的c.863位点发生4个碱基对的框外插入，导致蛋白质C末端的核仁定位信号（nucleolar localization signal, NuLS）丧失，进而引起蛋白质从细胞核错误定位到细胞质。目前已知的NPM1突变类型超过50种，但临床常规监测的通常仅限于最常见的A、B、D三种类型。

NPM1突变作为白血病特异性标志物具有独特优势：它们是AML的特异性驱动突变，表达水平高，通常存在于整个白血病细胞群体中，且在疾病过程中几乎保持稳定。尤其重要的是，在不存在预后不良的共突变（如FLT3-ITD）的情况下，NPM1突变通常与较好的预后相关。然而，诱导治疗后低水平NPM1突变的持续存在与疾病复发和不良预后密切相关，这使得NPM1突变检测在微小残留病（measurable residual disease, MRD）监测中具有重要价值。

尽管欧洲白血病网络（European LeukemiaNet, ELN）推荐使用基于cDNA的定量PCR方法进行NPM1 MRD监测，但这种方法存在局限性。不同实验室使用的检测方法通常只能覆盖少数常见突变类型，且cDNA检测结果受到目标基因和参考基因表达变异的影响，而基于gDNA的方法能更准确地反映白血病细胞的绝对比例。此外，gDNA的更高稳定性使样本处理更加简便。这些因素促使研究人员开发一种能够同时检测多种NPM1突变类型的高灵敏度方法。

在这项发表于《Clinical Chemistry》的研究中，来自荷兰格罗宁根大学医学中心的研究团队开发了一种创新的多重微滴式数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）检测方法，可同时测量10种不同NPM1突变的变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF）和mRNA转录本。该方法采用了一种通用探针、一种通用反向引物和10种突变特异性正向引物的巧妙设计，不仅提高了检测效率，还大大增强了方法的灵活性和可扩展性。

研究团队采用的关键技术方法包括：多重ddPCR检测体系设计（使用通用NPM1探针和反向引物配合突变特异性正向引物混合）、检测性能验证（包括分析灵敏度、特异性、线性范围和动态范围评估）、以及临床样本验证（使用来自2017-2023年间格罗宁根大学医学中心收治的NPM1突变AML患者的诊断和随访样本，包括47份骨髓和13份外周血诊断样本，以及16份骨髓和1份外周血随访样本）。

检测设计

研究人员设计的检测方法核心在于其巧妙的多重检测策略。如图1所示，该方法使用一个通用的6-羧基荧光素标记的NPM1探针和一个通用的NPM1反向引物，配合一组不同的突变特异性正向引物。初始混合物包含5种针对研究队列中已知的5种不同NPM1突变的正向引物，随后又添加了5种针对其他罕见突变的正向引物。为量化突变NPM1 cDNA转录本水平，使用ABL1表达作为参考基因；为测量突变NPM1 gDNA VAF%，使用AP3B1参考基因。

多重检测能力

研究证实，在PCR试剂混合物中存在多个未使用的正向引物不会干扰各个不同NPM1变异的定量。如图3所示，相关性图显示无论是使用cDNA还是gDNA，相关系数均高达0.9987至0.9999，斜率与1.00无统计学差异。当向混合物中添加另外5种新的正向引物时，单个NPM1变异的ABL1标准化NPM1转录水平和VAF均无统计学差异，证明该多重检测体系具有出色的稳定性和可靠性。

分析灵敏度和特异性

该方法显示了可忽略的假阳性背景信号和高检测精度。根据临床和实验室标准协会的EP17指南和数字MIQE指南，研究人员通过测量60个NPM1突变阴性对照样品的重复来确定检测空白（limit of blank, LoB）和检测限（limit of detection, LoD）。对于cDNA，LoB为0.0035%（突变NPM1转录本/ABL1转录本），LoD为0.020%；对于gDNA，LoB VAF为0.0008%，LoD VAF为0.007%。在0.04% NPM1/ABL1转录本水平下，检测的平均批内和批间变异系数分别为21.7%和16.9%；在0.02% VAF水平下，分别为19.0%和28.9%。

线性和动态范围

通过将诊断样本的10倍cDNA和gDNA稀释系列在正常骨髓样本（normal bone marrow, NBM）cDNA或gDNA中进行测试，研究人员确定了所有10种不同NPM1突变的线性和动态范围。使用包含所有10种不同正向引物的混合物在NBM样本中产生的背景信号低于LoB，且稀释系列延伸至cDNA和gDNA的LoD值以下的阳性值，最佳线性（R²）范围对于cDNA为0.987至0.998，对于gDNA为0.983至0.995。

方法比较

与之前用于常规临床诊断的定量PCR分析结果相比，ddPCR结果显示出极好的一致性。令人惊讶的是，患者诊断样本在使用ddPCR时显示出显著更高的VAF，这表明ddPCR在检测灵敏度方面可能优于下一代测序技术。

AML患者的临床验证

在47份骨髓和13份外周血诊断样本以及16份骨髓和1份外周血MRD阳性随访样本中测试了开发的ddPCR检测方法。在诊断样本中，突变NPM1与ABL1转录本的平均百分比为1106%（范围：391%-2420%），骨髓样本中的平均值（1167%）略高于外周血样本（885%）。平均gDNA VAF为42%，骨髓和外周血样本之间无显著差异。在随访样本中，平均ABL1标准化NPM1转录本为7.5%，平均VAF为0.084%。

为确定每个样本中NPM1突变表达与NPM1突变VAF之间的相关性，研究人员计算了突变NPM1转录本百分比与VAF的比值。在诊断样本中，平均比值为26.5（范围：9.4-55.6），而在随访样本中，比值显著更高且变异更大（平均：65.2，范围：7.8-267）。这种差异部分归因于ABL1表达水平的变化——诊断样本中的平均ABL1表达（4689 copies/μL）显著高于随访样本（1719 copies/μL）和正常供体样本（1855 copies/μL）。

特别值得注意的是，伴有FLT3-ITD共突变的诊断样本显示出更高的ABL1表达水平（平均：5574 copies/μL），而不伴有FLT3-ITD的样本平均为4099 copies/μL。ABL1表达最高的5个诊断样本显示出较低的ABL1标准化NPM1转录本表达水平和较低的cDNA/gDNA比值趋势。按NPM1类型分层显示，A型突变的cDNA/gDNA比值（平均：25.7）略低于D型突变（平均：37.4），这可能与FLT3-ITD共突变样本数量相对较多有关。

研究结论与意义

该研究首次报道了一种覆盖10种NPM1突变的多重ddPCR检测方法，可同时检测突变NPM1转录本和突变NPM1 gDNA分子，覆盖超过93%的NPM1突变AML病例。与常用的实时定量PCR相比，ddPCR方法具有直接准确定量无需校准曲线、多重检测能力减少加样偏差以及受PCR抑制剂影响较小等优势。

研究结果证实，虽然突变NPM1表达与突变NPM1 VAF之间存在良好的整体相关性，但对于某些患者，白血病NPM1转录本负荷与突变NPM1 gDNA VAF之间的关系可能存在显著波动。特别是在伴有FLT3-ITD共突变的AML患者中观察到不一致的结果，这表明仅测量RNA可能会产生误导性结果。

基于这些发现，研究人员推荐使用gDNA基础的突变NPM1 MRD分析方法，VAF检测限为0.01%。对于低于0.01%阈值的MRD信号，可以使用更敏感的mRNA基础分析方法，尽管这些较低MRD信号的临床相关性尚待确定。

该研究的创新之处在于其检测方法的灵活性和可扩展性——通过简单地向引物混合物中添加额外的突变特异性正向引物，即可轻松扩展以覆盖其他NPM1突变，从而实现最大诊断灵敏度。这一特点为临床实验室提供了重要优势，使其能够在可用的RNA和gDNA样本之间进行选择，并根据具体需求优化检测策略。

总之，这项研究为AML患者的MRD监测提供了一种强大而灵活的工具，有望改善NPM1突变AML患者的风险分层和治疗决策。然而，研究人员也指出，由于样本量有限，需要进一步的临床多中心验证研究来评估极低NPM1 MRD水平和/或不同NPM1表达水平对日常临床实践的相关性。