《Food Bioscience》：Boosting (
E)-Nerolidol Yield in
Serratia marcescens via Nerolidol Synthase Engineering and Competitive Pathway Knockout
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通过整合代谢工程与蛋白工程优化，利用溶剂耐受的Serratia marcescens HBQA7为底盘微生物，首次实现了高效(E)-nerolidol生物合成，产率达70.50 g/L，突破传统合成瓶颈。
陈娜|苟林波|刘迪|吴胜芳|周秀文|范太平|王龙|蔡玉杰
中国江南大学生物技术学院工业生物技术国家重点实验室，无锡214122
摘要
(E)-神经醇是一种天然存在的倍半萜醇，在食品工业中广泛应用，但其生产过程中存在微生物毒性和天然合成酶催化效率低的问题。利用具有优异溶剂耐受性的枯草芽孢杆菌HBQA7（一种理想的萜类生物合成底盘），我们通过整合代谢工程和蛋白质工程首次实现了高效生产(E)-神经醇。通过使用增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合表达技术筛选出来自猕猴桃的AcNES1作为最优合成酶，并通过优化连接子(GGSGGGGGSGGGSTS)将其活性提升至4.21 g/L。进一步对AcNES1进行理性工程改造，得到双突变体I323V/S428T，使产量提高到5.11 g/L。利用CRISPR-Cas9技术组合敲除竞争途径(ΔslaAB、ΔldhA、ΔpoxB)，产量进一步提高了27.6%，达到6.52 g/L。最终，在5 L发酵罐中实现了70.50 g/L的(E)-神经醇产量，这是迄今为止报道的最高产量，也标志着枯草芽孢杆菌作为高效(E)-神经醇生物合成平台的成功应用。
引言
(E)-神经醇是一种天然存在的倍半萜醇，呈无色至淡黄色粘性油状，具有独特的玫瑰苹果香气。作为一种安全的调味剂和防腐剂，它广泛应用于苹果、混合水果和柑橘类食品调味品中（McGinty等人，2010年）。同时，作为一种强效的天然抗菌剂，与羟丙基-β-环糊精结合后，可在食品包装中形成缓释纳米纤维膜，使草莓腐败真菌的抑制效果提高5.56倍（Zhang等人，2025年），显示出其在食品保鲜方面的多功能潜力。除了食品领域，它还可用于开发环保型农药，减少农业中的化学残留物和环境影响（Chen等人，2020年；Moura等人，2021年）；药理学研究证实其具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤和抗疟疾等多种生物活性（de Moura等人，2021年；Lei等人，2024年；Saito等人，2016年；Silva等人，2014年）。随着全球对天然替代品需求的增加，这种植物来源的化合物成为生物生产研究的高价值目标。
传统的神经醇提取和化学合成方法面临原料有限和环境问题的挑战。微生物发酵因其可持续性、环境友好性和大规模生产的可行性而成为一种有前景的替代方案。多个研究团队探索了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、脂肪分解酵母(Yarrowia lipolytica)和大肠杆菌(Escherichia coli)等微生物作为神经醇的生产宿主。Li等人通过表达来自Celastrus angulatus的神经醇合成酶(NES) CaNES2，并结合GAL80基因缺失和ERG9启动子替换，实现了5 L fed-batch发酵中7.01 g/L的trans-神经醇产量（Li等人，2021年）。Liu等人在脂肪分解酵母中表达了来自猕猴桃的FaNES1合成酶，并通过蛋白质工程、内源性3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)和肉碱乙酰转移酶(CAT2)的过表达以及过氧化物酶体途径的隔离，使产量达到11.10 g/L（Liu等人，2022年）。Tan等人筛选了7种NES酶，发现来自Fragaria x ananassa的FaLNS在大肠杆菌中最活跃。通过启动子工程、基因编辑和两相提取技术，他们的优化系统在5 L发酵罐中4天内生产出了约16 g/L的神经醇（Tan等人，2023年）。然而，神经醇的亲脂性会破坏微生物细胞膜，嵌入酿酒酵母和大肠杆菌的脂质双层中，导致钾离子泄漏和能量代谢受损，从而抑制生长（Brehm-Stecher等人，2003年；de Moura等人，2021年；Sperotto等人，2013年）。因此，选择对萜类化合物具有天然耐受性的微生物宿主是克服这一生产瓶颈的关键策略。
为了解决这些问题，我们采用了耐溶剂的枯草芽孢杆菌HBQA7，该菌已显示出香叶醇和(-)-α-双abolol的生产能力（Liu等人，2025年；Lu等人，2025年）。通过组合代谢工程和酶工程，我们通过GFP融合筛选确定了来自猕猴桃的AcNES1作为最优合成酶，通过优化连接子和I323V、S428T位点的突变提高了催化效率，并通过CRISPR-Cas9技术敲除了竞争途径ΔslaAB、ΔldhA和ΔpoxB，从而实现了70.50 g/L的(E)-神经醇产量。这一集成方法不仅创下了迄今为止的最高产量记录，也证明了枯草芽孢杆菌作为下一代萜类生物合成平台的潜力。
菌株、质粒和培养
本研究使用的菌株详见表1和表2。基因合成和密码子优化由北京基因组研究所(BGI)完成。引物由GENCEFE Biotech（中国无锡）合成。2×Phanta UniFi Master Mix (Dye Plus)和质粒提取试剂盒购自Vazyme Biotech Co., Ltd.（中国南京）。无缝克隆试剂盒(ABclonal MultiF Seamless Assembly Mix)来自ABclonal（中国武汉）。用于聚合酶实验的质粒和引物
异源NES酶的筛选
为了在枯草芽孢杆菌HBQA7中实现高产(E)-神经醇，我们整合了外源MVA途径（Lu等人，2025年），其中NES酶催化FPP的最终转化为(E)-神经醇。由于NES同源物之间的催化效率存在显著差异，我们优先选择了六种具有已知活性的候选酶：在大肠杆菌和酿酒酵母中验证有效的猕猴桃AcNES1（Green等人，2012年）、在大肠杆菌中验证有效的Fragaria x ananassa FaNES1（Aharoni等人，2004年）等。
结论
本研究通过整合酶工程和代谢工程，成功将枯草芽孢杆菌HBQA7改造为高效的(E)-神经醇生产底盘。首先通过GFP融合NES变体的异源筛选确定了AcNES1作为最优合成酶，并通过使用灵活的连接子(GGSGGGGGSGGGSTS)优化了其融合构象，实现了4.21 g/L的初始产量。随后，基于结构的理性设计进一步优化了该酶的活性
CRediT作者贡献声明
吴胜芳：资源支持。
周秀文：资源支持。
苟林波：写作、审稿与编辑、实验研究。
刘迪：软件开发。
陈娜：初稿撰写、数据可视化、实验研究。
蔡玉杰：项目管理。
范太平：方法学设计。
王龙：实验指导
未引用文献
Brehm-Stecher和Johnson，2003年；Chatrdooz和Sargolzaei，2025年；Choi等人，2019年；Hollingsworth和Dror，2018年；Krivák和Hoksza，2018年；Nakamura和Abeles，1985年；Rashtchian和Booth，1981年。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据可用性
支持本文的数据已作为补充信息提供。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
作者是该期刊的编委会成员/主编/副主编/特邀编辑，未参与本文的审稿或发表决定。
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
致谢
本研究未获得任何公共、商业或非营利机构的资助。
