《Gene》：N1 and N2 neutrophil phenotypes may play differential roles in stimulating the endochondral ossification behaviors of ATDC5 cells
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中性粒细胞亚型N1和N2通过调节ATDC5细胞中SOX9、COL2A1、RUNX2等基因表达和MMP-13、COX2等标志物，影响软骨细胞成熟和成骨分化进程，揭示其调控骨再生的不同作用机制。
作者：方舟·卢（Fangzhou Lu）、安迪·克雷默斯（Andy Cremers）、马蒂恩·波泽（Martijn Poeze）、马蒂恩·范·格里恩斯文（Martijn van Griensven）、蒂姆·J.M. 韦尔廷（Tim J.M. Welting）、塔科·J. 布洛赫胡伊斯（Taco J. Blokhuis）、玛乔莱因·M.J. 卡龙（Marjolein M.J. Caron）
所属机构：荷兰马斯特里赫特大学MERLN技术驱动再生医学研究所细胞生物学与组织工程系，地址：Universiteitssingel 40, 6229 ER Maastricht
摘要
目的
软骨内成骨对骨骼愈合至关重要，中性粒细胞在骨免疫系统中起着关键作用。虽然N1（促炎型）和N2（再生型）中性粒细胞在其他研究中有报道，但它们在软骨内成骨中的作用仍不明确。本研究探讨了这两种中性粒细胞对ATDC5细胞的影响。
方法
从五名健康志愿者中分离出中性粒细胞，并将其极化为N0（未刺激状态）、N1或N2表型。培养4小时后，将中性粒细胞条件培养基（20%体积比）与软骨形成诱导培养基（DM）混合。ATDC5细胞分别在混合培养基和单独的DM中培养24小时，之后继续在DM中培养。在第7天和第14天，检测了多种基因表达、ALP活性和TGF-β3水平。
结果
SOX9在A/N2组中于第7天达到峰值，而A/N1组在第14天表现出最高水平。COL2A1在A/N0组中于第7天升高。RUNX2在A/N1和A/N2组中均升高，并且在A/N1组中持续升高至第14天。MMP-13在A/N1组中于第7天显著升高。COL10A1的表达没有显著变化。COL1A1和COX2在A/N1组中持续升高。ALP活性在A/N1组中始终增强，而TGF-β3在A/N1和A/N2组中于第14天均降低。
结论
本研究表明，N1中性粒细胞可能促进软骨细胞成熟和成骨分化，而N2中性粒细胞可能支持细胞增殖、肥大和成熟，为成骨过程提供细胞储备。这些发现突显了它们在引导软骨前体向骨骼而非软骨方向分化中的不同作用。
引言
骨骼愈合通过两种过程发生：膜内成骨和软骨内成骨（Breeland等人，2023年）。软骨内成骨是骨骼发育和骨折愈合的关键过程，始于间充质干细胞（MSCs）分化为软骨细胞，这些软骨细胞进一步成熟为肥大软骨细胞，然后产生逐渐矿化的软骨基质（Shapiro，2008年；Mackie等人，2008年；Du等人，2023年；Beier，2005年；Hu，2017年）。这种矿化对于通过协调的细胞活动最终将软骨替换为骨骼至关重要（Mackie等人，2008年；Ortega等人，2004年）。
关于骨免疫系统的研究日益受到关注，该系统探讨了骨骼系统和免疫系统之间的相互作用，包括骨折愈合领域（Longoni，2018年）。中性粒细胞作为最先到达骨折部位的免疫细胞，已被证明对骨骼再生既有积极作用也有负面影响（Lu，2024年；Baht等人，2018年；Kovtun等人，2018年；Kovtun，2016年；Herath等人，2018年；Bastian等人，2016年）。例如，骨折前中性粒细胞的减少会阻碍愈合，而骨折部位中性粒细胞的过度浸润会损害骨骼再生。这些相反的效果可能源于中性粒细胞的多重作用，包括其对细胞外基质形成和矿化的调节、中性粒细胞外陷阱（NETs）的产生，以及与多种细胞因子的相互作用。这种双重性引发了人们对中性粒细胞亚型N1（促炎型）和N2（再生型）在愈合过程中具体作用的理解兴趣（Lu，2024年；Cai，2021年）。
这两种中性粒细胞亚型在骨折愈合中的研究日益增多（Lu，2024年；Cai，2021年；Shu等人，2024年）。多项研究表明，N1中性粒细胞主要与炎症相关，而N2中性粒细胞具有促进骨骼再生的特性（Lu，2024年；Cai，2021年）。此外，这些研究提示在骨折愈合过程中，N1中性粒细胞表型能够逐渐转变为N2表型，表明愈合过程从炎症阶段逐渐转向再生阶段（Lu，2024年；Cai，2021年）。尽管这两种中性粒细胞亚型对成骨作用的影响已开始被研究，但它们如何影响软骨内成骨过程中的软骨形成阶段仍不清楚。
在本研究中，我们假设N1和N2中性粒细胞在ATDC5细胞的软骨内成骨过程中可能发挥不同作用。为了清晰地观察软骨形成与成骨的分化过程，我们选择了一组标志基因：SOX9（SRY-box转录因子9）和COL2A1（II型胶原α1链）作为软骨细胞身份和软骨基质形成的典型指标；COL10A1（X型胶原α1链）和MMP-13（基质金属蛋白酶-13）作为软骨细胞肥大和基质重塑的标志物；RUNX2（runt相关转录因子2）、COL1A1（I型胶原α1链）和COX2（环氧化酶2）作为早期成骨分化的标志物，表明软骨向骨骼的转变。这组标志物已在体外和体内研究中广泛用于区分早期软骨维持、肥大和成骨转化（Giuliani，2013年；Jeyakumar，2017年）。鉴于软骨内成骨在骨折修复中的核心作用，本研究旨在深入理解N1和N2中性粒细胞表型在骨折愈合中的作用。
伦理声明
本研究使用人类中性粒细胞已获得马斯特里赫特大学医学中心伦理审查委员会的批准（申请编号：METC 24-001）。所有捐赠外周血的健康志愿者均签署了知情同意书。所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》（2013年修订版）的原则进行。
分离人类外周血中的中性粒细胞
使用含有K2EDTA的BD Vacutainer管从健康志愿者（年龄≥18岁）中采集外周血（Becton公司生产）
结果
从五名健康捐赠者（平均年龄28±1岁；1名女性）中分离出中性粒细胞，并在体外将其极化为不同的中性粒细胞表型。通过比较第0天与第7天和第14天的基因表达，证实ATDC5细胞在无中性粒细胞条件培养基刺激的情况下成功发生了软骨形成分化，表现为SOX9和COL2A1基因表达上调。此外，RUNX2、COL10A1和MMP-13的基因表达也相对增加（见图2），表明软骨细胞持续肥大。
讨论
最近的研究强调了特定中性粒细胞表型N1和N2在骨骼再生中的双重作用（Lu，2024年；Cai，2021年）。然而，它们在软骨内成骨这一骨骼发育关键阶段中的作用仍需进一步探索。了解这些中性粒细胞的表型特异性效应有助于揭示它们在此过程中的作用。
作者贡献声明
方舟·卢：撰写初稿、软件开发、方法设计、数据管理、概念构思。安迪·克雷默斯：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析。马蒂恩·波泽：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。马蒂恩·范·格里恩斯文：撰写、审稿与编辑、数据可视化、验证、项目监督、概念构思。蒂姆·J.M. 韦尔廷：撰写、审稿与编辑、项目监督。
资助
该项目得到了荷兰关节炎基金会的财政支持（资助编号：LLP14）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们衷心感谢Anna J. L. Lodewijks在获取伦理批准方面提供的宝贵帮助和贡献。
