利用基于染色体不稳定性的特征来预测乳腺癌的预后和免疫特征

《General and Comparative Endocrinology》：Leveraging a chromosomal instability-based signature to predict the prognosis and immune landscape of breast cancer

染色体不稳定性（CIN）在乳腺癌预后、免疫微环境和药物敏感性中的研究。基于TCGA-BRCA队列，通过无监督聚类构建CIN25基因分型，筛选13个核心基因形成CIN评分。结果显示，高CIN评分组临床预后差、免疫微环境浸润低，且对化疗、内分泌及靶向药物敏感性降低。CIN评分可预测乳腺癌预后、免疫状态及药物响应，为精准治疗提供新工具。

　　乳腺癌是一种高度异质性的疾病，影响全球众多女性。根据世界卫生组织的统计数据，乳腺癌仍然是女性中最常见的诊断癌症之一，占所有女性恶性肿瘤的近30%。尽管近年来在治疗方面取得了显著进展，但仍有相当数量的患者在治疗过程中出现新的或获得性耐药，导致疾病进展或远处转移。肿瘤进展成为长期癌症管理的严峻挑战，尤其是那些具有转移倾向的乳腺癌患者，通常预后较差。

染色体不稳定性（CIN）被认为是癌症的一个标志性特征，它指的是在连续细胞分裂过程中持续存在的染色体分离错误。大约90%的实体瘤显示出一定程度的非整倍体现象。乳腺癌的基因组常常是四倍体或接近三倍体。此外，基因组中还存在如ERBB2扩增等段落拷贝数变异现象。研究人员将CIN分为数值性染色体不稳定性（nCIN）和结构性染色体不稳定性（sCIN）。nCIN通常指整条染色体的获得或丢失，而sCIN涉及染色体重排或片段的增减。CIN可能由缺陷的有丝分裂、转录应激、致癌基因诱导的复制应激以及DNA损伤修复缺陷等多种机制引起。由于评估CIN的难度，Carter等人于2006年提出了CIN25基因签名，用于评估CIN水平，并预测乳腺癌的预后。

随着生物信息学技术的不断发展，我们认识到，利用新的生物信息学方法，深入探讨CIN如何影响乳腺癌的预后和肿瘤免疫微环境（TIME）将为靶向CIN提供新的思路。然而，目前针对利用CIN相关变量预测乳腺癌预后和免疫景观的研究仍较为有限。因此，我们旨在利用新的生物信息学方法，全面分析乳腺癌中的CIN25签名，并构建一个简化的CIN相关风险模型。

免疫治疗，特别是针对TIME而非肿瘤细胞本身的疗法，为乳腺癌治疗提供了新的希望。免疫检查点抑制剂（ICIs）如PD-1抑制剂帕博利珠单抗，在三阴性乳腺癌（TNBC）的临床试验中已被测试。对于早期TNBC，帕博利珠单抗联合新辅助化疗，随后辅助帕博利珠单抗治疗，可改善无病生存期（DFS），且不受肿瘤PD-L1表达水平的影响。对于PD-L1阳性的转移性TNBC，帕博利珠单抗联合化疗已成为一线治疗的新标准，并能提高总生存期（OS）。然而，由于乳腺癌的高度异质性，识别哪些患者能从ICIs中获益仍具挑战性。先前的研究表明，非整倍体可能与黑色素瘤患者对ICIs的不良反应相关。这为探索基于CIN变量的更有效生物标志物，以识别最可能对ICIs产生积极反应的乳腺癌患者提供了依据。

在本研究中，我们利用The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库中的RNA转录组数据，提出了一种新的CIN相关基因签名，称为“CIN评分”。我们应用了多种算法，包括机器学习、富集分析和免疫浸润分析，以评估CIN评分在预测乳腺癌生存结局和免疫景观中的能力。这些结果通过外部队列Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium（METABRIC）进行了验证。此外，我们还通过单细胞RNA测序数据（scRNA-seq）探索了CIN评分基因在不同细胞类型中的表达模式。研究流程如图1所示。

为了确定CIN评分的预测能力，我们首先进行了单变量Cox回归分析，以识别具有预后意义的差异表达基因（DEGs）。然后，通过“glmnet”R包进行LASSO算法分析，进一步筛选出具有预后意义的基因，并通过多变量Cox回归分析确定了13个独立预测基因，构建了一个新型的预后基因签名，即“CIN评分”。CIN评分的计算基于这些基因的表达水平和相应的系数。为了后续分析，我们将乳腺癌患者分为低CIN评分组和高CIN评分组，依据评分中位数进行分组。我们对患者的生存状况进行了排序，并展示了每位患者的生存结局。通过Sankey图，我们发现高CIN评分的患者预后较差，这得到了Kaplan-Meier分析的支持，显示低CIN评分组的总生存期显著优于高CIN评分组（P < 0.0001）。为了评估CIN评分的预测准确性，我们生成了1、3和5年总生存期（OS）的ROC曲线，其曲线下面积（AUC）分别为0.796、0.755和0.764，表明CIN评分在预测OS方面表现良好。

我们还比较了两组患者的临床病理参数。图4I–N显示，低CIN评分组具有更有利的临床特征，如更多的病理阶段I–II患者（P < 0.001）、T1患者（P = 0.008）、N0患者（P < 0.001）以及HER2阴性患者（P < 0.001）。这些发现表明，CIN评分可能成为乳腺癌预后评估的一个有力工具。

基于多变量Cox回归分析的结果，我们构建了一个包含独立预后因素的CIN评分模型，用于准确预测乳腺癌患者的总生存期（OS）。该模型通过校准曲线验证了其稳定性，并通过ROC曲线评估了其预测性能。决策曲线分析（DCA）进一步显示，与仅基于临床参数的模型相比，CIN评分模型的临床益处率更高，有助于改善临床管理。

为了探讨CIN评分与预后之间的潜在机制，我们对低CIN评分组和高CIN评分组的差异表达基因（DEGs）进行了功能富集分析。结果发现，高CIN评分组中625个DEGs中，有139个基因表达上调，486个基因表达下调。GSEA分析显示，高CIN评分组富集了E2F目标、G2M检查点和Myc目标等与肿瘤增殖相关的通路。相比之下，低CIN评分组则主要富集了免疫相关通路，如干扰素-γ反应、TNF-α信号通过NF-κB以及炎症反应。KEGG和GO分析进一步揭示了高CIN评分组中下调基因主要富集在T细胞信号通路、Th1和Th2细胞分化、免疫反应以及趋化因子活性等通路。这些功能分析一致表明，高CIN评分组的肿瘤微环境具有免疫抑制特征。

我们的分析进一步支持了高CIN评分与乳腺癌不良预后之间的关系。高CIN评分与丰富的致癌通路、较少的免疫相关通路以及对多种治疗药物更高的IC50值相关。高CIN评分组富集了E2F目标、Myc目标和MTORC1信号通路等致癌通路，而低CIN评分组则富集了免疫相关通路，如T细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化以及免疫反应。因此，我们进一步进行了免疫浸润分析。

免疫浸润分析显示，低CIN评分组的免疫评分和CD4+ T细胞、CD8+ T细胞以及M1巨噬细胞的浸润水平均高于高CIN评分组，这与先前研究中高浸润的抗肿瘤免疫细胞预示良好临床结局的结果一致。此外，低CIN评分组的肿瘤表达水平较高的免疫检查点基因，如CTLA-4、PD-1和PD-L1，表明CIN评分可能有助于区分具有不同免疫治疗敏感性的乳腺癌患者。综合来看，我们的研究显示，较高的CIN评分代表了更侵袭性的表型、更缺陷的抗肿瘤免疫和更差的药物反应性，这可能是高CIN评分组预后较差的原因。

CIN25签名作为公认的泛癌种CIN生物标志物，其在乳腺癌中的应用潜力已被证实。为了开发更精确的工具，我们通过严格的生物信息学筛选（包括无监督共识聚类和LASSO回归）优化了这一签名。显著重叠（如UBE2C）确认了我们的模型保留了CIN的核心生物学特征。我们签名中的独特基因可能代表了乳腺癌特异性的CIN驱动因素或结果。因此，我们优化的13基因CIN评分在预测乳腺癌特异性预后、免疫浸润和药物耐药性方面表现出优于广泛CIN25签名的性能，为临床实践提供了更具体的参考。

尽管本研究取得了显著成果，但仍存在一些局限性。首先，研究基于公开数据库，未来需要通过多中心随机对照试验进一步验证结果。其次，某些CIN评分基因的生物学功能需要通过体外和体内实验进行验证。基于生物信息学算法的药物敏感性分析表明，高CIN评分的乳腺癌患者对多种治疗药物的敏感性较低，这一结果应通过细胞活力实验进一步验证。此外，我们采用多种算法（TIMER、CIBERSORT、quanTIseq和ssGSEA）来估计免疫细胞浸润。尽管由于方法学差异，各算法结果存在一些不同，但在所有方法中观察到的主要抗肿瘤免疫细胞（如CD4+ T细胞和CD8+ T细胞）在高CIN评分组和低CIN评分组之间表现出一致的浸润趋势，这加强了我们对肿瘤微环境结论的稳健性。未来的研究还应进一步探索CIN评分对免疫抑制细胞（如调节性T细胞和M2巨噬细胞）浸润的影响。

综上所述，我们的研究全面分析了乳腺癌中的CIN25基因签名，并创新性地提出了CIN评分。CIN评分在预测患者生存、TIME以及药物耐药性方面表现良好。PCR方法可用于测量CIN评分中的13个基因的表达水平，使其在临床实践中具有时间和成本效益，并易于应用。结合CIN评分的测量，可以帮助我们更好地识别高进展风险的乳腺癌患者。总体而言，这些发现可能为乳腺癌精准医学时代更有效的临床策略提供重要线索。