非甾体盐皮质激素受体拮抗剂Esaxerenone通过调节管球反馈改善糖尿病肾病肾小球高滤过及蛋白尿的机制研究

《Nephrology Dialysis Transplantation》：The Nonsteroidal Mineralocorticoid Receptor Blocker Esaxerenone reduces glomerular hyperfiltration and albuminuria

本研究聚焦糖尿病肾病(DKD)中肾小球高滤过的病理机制，探讨非甾体盐皮质激素受体拮抗剂Esaxerenone的肾脏保护作用。研究人员通过醛固酮灌注大鼠和db/db小鼠模型，结合活体多光子成像技术，发现Esaxerenone可通过恢复致密斑细胞中NKCC2膜表达，调节一氧化氮(NO)-腺苷信号通路，从而改善管球反馈(TGF)功能，纠正肾小球入球小动脉异常扩张，最终降低蛋白尿。该研究为nsMRA在DKD治疗中的临床应用提供了新的理论依据。

　　

在全球范围内，慢性肾脏病(CKD)影响着8.5亿人的健康，其中糖尿病肾病(DKD)是最主要的致病因素之一。尽管非甾体盐皮质激素受体拮抗剂(nsMRA)如Finerenone已在临床试验中展现出肾脏保护作用，但其具体机制，特别是对肾小球血流动力学的调节作用，尚未完全阐明。值得注意的是，临床使用nsMRA后会出现估算肾小球滤过率(eGFR)的初始下降，随后长期肾功能得以保护，这一现象与SGLT2抑制剂的作用模式相似，提示MR活性可能参与肾小球高滤过的调节。

近年来研究发现，盐皮质激素受体(MR)激活可能通过影响管球反馈(TGF)机制参与肾小球血流动力学调节。醛固酮刺激致密斑(MD)细胞可导致一氧化氮(NO)产生增加，从而削弱TGF功能。然而，MR激活在糖尿病肾病肾小球高滤过中的具体作用及MRA的抑制机制仍有待深入探索。

本研究基于"MR激活在致密斑细胞中通过损害TGF功能导致肾小球高滤过，而非甾体MRA Esaxerenone可通过恢复TGF功能减轻高滤过和蛋白尿"的假设，开展了一系列实验验证。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用醛固酮灌注的SD大鼠和2型糖尿病模型(db/db)小鼠作为研究对象；通过活体多光子成像技术实时观察单个肾单位肾小球滤过率(SNGFR)和小动脉直径变化；利用致密斑细胞系(MDgeo)进行体外实验，探讨MR激活对TGF相关信号通路的影响；通过Western blot、免疫荧光等技术分析蛋白表达变化。所有动物实验均在日本川崎医科大学进行，符合该机构动物实验伦理委员会的要求。

生理生化数据和醛固酮诱导的MR激活对肾小球血流动力学的影响

为评估MR激活对肾脏微循环的影响，研究人员给SD大鼠灌注醛固酮并分析其引起的变化。醛固酮治疗组血压显著升高，而Esaxerenone治疗可明显缓解这一升高。组织学分析显示三组间肾小球损伤或间质纤维化无显著差异。

活体成像显示，醛固酮治疗组SNGFR显著增加，表明存在肾小球高滤过。此外，醛固酮治疗组出现入球小动脉扩张，而Esaxerenone治疗可纠正这一现象。出球小动脉直径在Esaxerenone组显著小于醛固酮组。醛固酮治疗组的入球/出球小动脉比率(AA/EA)显著高于对照组，而Esaxerenone显著降低了这一比率。肾小球大小不受任何治疗影响。这些发现表明，醛固酮诱导的MR激活通过入球小动脉扩张导致肾小球高滤过。

糖尿病肾病模型小鼠的肾小球血流动力学及Esaxerenone对肾小球高滤过的纠正作用

研究人员使用2型糖尿病模型小鼠探讨Esaxerenone对肾脏血流动力学的影响。在db/db和db/db+Esax组中，收缩压、脉率和血清肌酐水平较db/m+组显著降低，而体重和血糖水平显著升高。db/db+Esax组与db/db组之间无显著差异。

db/db小鼠出现系膜基质扩张和足细胞形态改变(如足突effacement)，Esaxerenone治疗改善了这些病理变化。db/db组尿白蛋白排泄显著高于db/m+组，但Esaxerenone治疗降低了尿白蛋白排泄。db/db组SNGFR增加，Esaxerenone治疗减轻了这一现象。db/db小鼠出现入球小动脉扩张，Esaxerenone治疗纠正了这种扩张。各组出球小动脉直径无显著变化。AA/EA比率仅在db/db组升高。此外，db/db+Esax组尿腺苷水平显著高于db/db组。这些发现表明，MR阻断对DKD肾小球高滤过的纠正作用是通过腺苷信号介导的TGF实现的。

腺苷受体拮抗剂减弱MRB对糖尿病肾病肾小球高滤过的纠正作用

为阐明MR活性与腺苷信号通过TGF的关系，研究人员增加了一个腺苷A1受体(A1aR)拮抗剂治疗组进行分析。与先前实验一致，db/db组SNGFR显著增加，表明存在肾小球高滤过。db/db+Esax组SNGFR较db/db组显著降低，显示Esaxerenone对肾小球高滤过的纠正作用。然而，在A1aR拮抗剂联合治疗组中，SNGFR较db/db+Esax组显著增加，表明Esaxerenone对肾小球高滤过的纠正作用被腺苷受体拮抗剂减弱。

db/db组出现显著入球小动脉扩张，db/db+Esax组入球小动脉扩张得到显著纠正，而db/db+Esax+A1aR拮抗剂组较db/m+和db/db+Esax组出现显著入球小动脉扩张。各组出球小动脉直径无显著变化。AA/EA比率仅在db/db组升高。这些发现表明，MR激活在DKD肾小球高滤过中发挥作用，且这一作用通过TGF通路介导，腺苷信号抑制后Esaxerenone效应减弱证明了这一点。

MR激活调节致密斑细胞中的NO和腺苷信号

研究人员使用分化的MDgeo细胞探讨MR激活对NO产生和腺苷分泌的影响。分化的MDgeo细胞呈现纺锤形形态，表达定位于细胞膜的GFP。

与未分化细胞相比，分化细胞NKCC2、COX-2和MR蛋白表达更高。醛固酮刺激后SGK1表达显著增加，而Esaxerenone预处理减弱了这一反应。通过两种独立方法评估NO产生：使用NO敏感性染料(DAX-J2TM Red)进行活细胞荧光成像，以及使用Cell Meter?荧光法量化细胞内NO水平。醛固酮刺激显著增加NO产生，而Esaxerenone和nNOS抑制剂均可减少这一作用。培养上清液中腺苷浓度在Esaxerenone和nNOS抑制剂治疗组中显著高于单独醛固酮组。这些结果表明，醛固酮诱导的MD细胞MR激活增强NO产生并抑制腺苷释放，而MR阻断逆转这一效应，从而可能恢复TGF信号。

MR激活通过nNOS介导的NO产生降低致密斑细胞中NKCC2表达

NKCC2膜表达水平取决于其产生、运输和降解之间的平衡。通常只有3-5%的NKCC2存在于厚升支细胞顶膜，大部分位于顶膜下区室。NKCC2在细胞膜上的半衰期约1小时，其水平受到胞吐、内吞和循环的严格调控。

研究人员探讨了MD细胞中MR激活诱导的NO产生增加对NKCC2膜表达的影响。免疫荧光分析证实NKCC2主要定位于细胞膜，其表达在醛固酮刺激后降低。放大图像显示醛固酮治疗后NKCC2表达变得不连续。然而，Esaxerenone和nNOS抑制剂治疗后其表达得以恢复。从MDgeo细胞提取膜蛋白，Western blot评估NKCC2表达。醛固酮刺激降低NKCC2表达，而Esaxerenone或nNOS抑制剂处理保留了其表达。使用甾体MRB螺内酯的额外实验显示，在NO产生或NKCC2膜定位方面与非甾体MRB Esaxerenone无显著差异。

Esaxerenone维持db/db小鼠致密斑细胞中NKCC2表达

为评估体内致密斑细胞NKCC2表达，研究人员对db/m+、db/db和Esaxerenone治疗的db/db小鼠肾脏冰冻切片进行免疫荧光染色。

db/m+小鼠致密斑区域相应肾小管段可见明显NKCC2表达。相比之下，db/db小鼠这些区域NKCC2表达显著降低。Esaxerenone治疗保留了致密斑中NKCC2表达。此外，研究人员探索了CCN1(CYR61)的参与，但Esaxerenone的抗蛋白尿效应似乎独立于CCN1信号。

本研究旨在阐明nsMRA在DKD中肾脏保护的分子机制。研究人员假设MD细胞中MR激活通过TGF机制调节DKD肾小球血流动力学，并评估nsMRA抑制DKD肾小球高滤过的作用。醛固酮全身给药诱导的MR激活导致大鼠肾小球入球小动脉扩张，促进肾小球高滤过。Esaxerenone改善糖尿病小鼠肾小球高滤过并减少蛋白尿。这一反应涉及通过关键TGF信号分子腺苷介导的纠正肾小球入球小动脉过度扩张。

MD细胞实验显示，MR激活增强NO产生并降低细胞膜NKCC2表达。Esaxerenone和nNOS抑制剂减弱了这些现象。本研究证明nsMRA Esaxerenone通过改善TGF信号抑制DKD肾小球高滤过。同时揭示MD细胞MR激活参与DKD肾脏微循环动力学异常。

MR激活已知促进DKD进展。即使血浆醛固酮水平低或正常范围内，MR仍可被激活并促进肾损伤，凸显MR拮抗剂的治疗潜力。本研究主要关注致密斑MR信号，因此所有实验组喂食相同高盐饮食以统一增强MR激活。在肥胖或糖尿病背景下，高盐摄入可通过醛固酮依赖和Rac1介导途径激活MR。初步正常盐饮食实验显示db/db小鼠仅出现轻度系膜扩张和肾小球高滤过，Esaxerenone无显著效应，支持高盐负荷对于在该模型中揭示MR依赖性TGF和肾小球血流动力学变化的重要性。

MR广泛表达于各种肾脏细胞类型。尽管本研究主要探讨致密斑MR信号，但血管平滑肌细胞MR激活也可能独立于腺苷A1受体信号促进糖尿病高滤过。先前兔微穿刺研究显示醛固酮输注诱导浓度依赖性MR激活，导致出入球小动脉收缩，出球小动脉收缩更强，这一机制理论上可能促进肾小球高滤过。但在本研究的醛固酮输注和糖尿病模型中，研究人员一致观察到入球小动脉扩张。这一差异可能由实验条件解释：兔研究中收缩在醛固酮给药后5分钟内出现，表明快速非基因组血管收缩效应，而本实验针对慢性MR激活。在本实验条件下，TGF调节似乎占主导。

据研究人员所知，尚无研究直接证明MR激活通过MD细胞调节糖尿病肾小球高滤过。本研究首次证明MR激活损害TGF功能，导致糖尿病肾病肾小球高滤过，而Esaxerenone通过恢复TGF功能改善高滤过。研究结果支持MR激活在MD细胞中通过增加NO产生损害TGF功能的假设。MR激活增强nNOS活性，增加NO产生，从而抑制腺苷生成。由于腺苷通过A1受体收缩入球小动脉，腺苷减少导致入球小动脉扩张和肾小球高滤过。MR阻断逆转这些变化，恢复腺苷水平和TGF功能。

NKCC2活性受表达和磷酸化调节。研究结果表明MD细胞MR激活通过增加NO产生影响NKCC2膜表达。

本研究存在若干局限性。首先，使用醛固酮研究MR激活对肾脏微循环动力学的影响，但醛固酮存在独立于MR的非基因组途径，难以区分MR激活本身与醛固酮特定作用。需要其他MR配体实验。其次，虽证明MD细胞MR激活促进肾小球高滤过，但MD细胞MR激活是否足以诱导高滤过尚不清楚。肾脏存在许多MR表达细胞，也可能贡献观察到的效应。评估非MD细胞MR激活影响是重要未来方向。第三，成像分析中选择最完整肾单位，但肾单位生理条件可能未完全保留。实验条件下血流动力学和组织应激反应变化可能影响数据。未来研究应纳入体内模型验证更生理条件下的发现。最后，所有实验仅在雄性小鼠进行，不能排除性别差异潜在影响。

本研究探讨nsMRA在DKD中肾脏保护机制，证明MR激活促进肾小球高滤过。特别证明MR激活通过MD细胞TGF调节肾小球微循环动力学。该研究发表于《Nephrology Dialysis Transplantation》，为理解nsMRA在糖尿病肾病中的治疗机制提供了重要见解，为开发针对肾小球高滤过的新治疗策略奠定了理论基础。