DNA:RNA杂合G-四链体（hG4）稳定性与解旋机制研究

《Nucleic Acids Research》：The stability and unfolding of DNA: RNA hybrid G-quadruplexes

本研究针对DNA:RNA杂合G-四链体（hG4）研究缺乏标准化制备方法的瓶颈，开发了光裂解连接子诱导的hG4可控生成技术。通过系统评估不同RNA/DNA组成的hG4稳定性规律，发现RNA含量越高则结构越稳定；筛选出高亲和力结合蛋白G4P，并首次证实Pif1和RHAU helicase可有效解旋hG4。该研究为hG4在转录调控和端粒稳定性中的功能研究提供了方法论基础。

　　

在基因组调控的微观世界里，G-四链体（G-quadruplex, G4）作为一种非经典核酸二级结构，近年来被发现是调控复制、转录和端粒维持的关键元件。其中由DNA和RNA链杂合形成的DNA:RNA杂合G-四链体（hybrid G-quadruplex, hG4）更因其在转录暂停和端粒保护中的独特功能而备受关注。然而由于hG4由不同核酸链杂合形成，传统退火方法会产生dG4、rG4和hG4的混合物，导致其稳定性研究和动态调控机制研究长期停滞。

针对这一技术瓶颈，遵义医科大学与河南大学联合团队在《Nucleic Acids Research》发表研究，开发了一种紫外诱导光裂解连接子（photocleavable linker, PC-linker）的hG4可控生成技术。通过将PC-linker嵌入G富集序列中部，先形成分子内G4后通过365 nm紫外照射精确切割，成功获得均一性良好的hG4(2+2)、hG4(3+1)和hG4(1+3)结构。

关键技术方法包括：PC-linker介导的hG4可控组装、圆二色谱（circular dichroism, CD）分析拓扑结构与熔解温度、电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）检测蛋白结合活性、体外转录系统验证生物功能，以及微尺度热泳动（microscale thermophoresis, MST）测定小分子结合常数。

hG4组成与稳定性关系

研究人员发现所有hG4变体均呈现典型平行结构特征（CD谱265 nm正峰）。通过CD熔解实验首次系统比较不同RNA/DNA组成的稳定性，显示hG4(1+3)>hG4(2+2)>hG4(3+1)的规律，证明RNA含量与热稳定性呈正相关（Tm分别为58.8°C±0.2°C、56.9°C±0.2°C、42.3°C±0.3°C）。

这一发现解释了细胞内hG4更易形成(1+3)构型的原因。

G4结合蛋白筛选

比较四种G4识别蛋白（BG4、D1、SG4、G4P）的结合特性，发现人工蛋白G4P对hG4亲和力最高（K_d=12.3±1.2 nM），且能显著提升hG4热稳定性。

该结果提示利用G4P进行基因组dG4成像时需考虑hG4干扰。

解旋酶功能鉴定

针对hG4解旋机制空白，团队构建带5‘/3’单链尾端的hG4底物，系统评估四类解旋酶活性。结果显示Pif1和RHAU可高效解旋hG4（最高效率>80%），而RecQ和DinG几乎无活性。

实验证实该过程依赖ATP水解和单链尾端加载，且复制蛋白A（replication protein A, RPA）虽能结合但无法解旋hG4。

转录系统中功能验证

在体外转录模型中，研究人员观察到两个RNase抗性的hG4条带，其形成依赖K⁺条件。加入RHAU或Pif1可剂量依赖性消除hG4信号，而G4稳定剂PDS（pyridostatin）能完全抑制解旋活性。

值得注意的是，G4P仅抑制RHAU而對Pif1无影响，可能与Pif1特有的蛋白置换能力有关。

本研究建立的PC-linker技术突破了hG4研究的制备瓶颈，首次揭示RNA组分对hG4稳定性的增强效应，并发现Pif1/RHAU作为潜在hG4解旋酶。这些发现为理解hG4在转录调控、端粒维持及相关疾病中的作用提供了新视角，建立的实验体系也为筛选hG4靶向药物奠定了方法学基础。未来研究可进一步探索hG4在活细胞中的动态变化及其与基因组稳定性的关联。