基于MALDI-TOF质谱技术的蜂蜜和蜜蜂花粉的脂质组学分析

《ACS Agricultural Science & Technology》：MALDI-TOF MS-Based Lipidomic Profile of Honey and Bee Pollen

针对蜂蜜和蜂花粉来源认证问题，本研究优化了固体-液体萃取结合MALDI-TOF MS分析方法，通过主成分分析成功区分了植物和地理来源，验证了脂质作为生物标志物的可行性，并评估了方法的绿色和实用性。

　　近年来，随着对蜂源产品（如蜂蜜和蜂花粉）的需求不断上升，这些产品中出现的掺假和标签错误问题也日益严重。这使得开发可靠的身份验证工具变得尤为重要。脂质作为蜂蜜和蜂花粉中的重要成分，具有潜在的溯源价值，可用于检测食品欺诈。本文介绍了一种优化的固液提取方法，结合了基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），用于初步筛查15种蜂蜜和13种蜂花粉中的脂质，总共检测到超过700种脂质，包括脂肪酰基、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂和甾醇脂等。首次利用主成分分析（PCA）对植物源和地理源进行分类，大多数样品得到了正确的归类。此外，该方法被评价为绿色（环境友好）和蓝色（实用）。

蜂源产品因其丰富的生物活性化合物而受到越来越多的关注，这些化合物被认为对健康有益。然而，由于植物源和地理源的多样性，这些产品的化学组成也存在显著变化。同时，环境条件和养蜂实践也会影响这些产品的组成。因此，通过化学分析来评估这些产品的真伪，成为一种有效的手段。为了应对这一需求，研究人员开始探索新的方法，如利用多变量统计工具和多种化学参数进行分析，以提高鉴定的准确性。在这些方法中，脂质作为生物标记物显示出巨大的潜力，因为它们的结构多样性使其对环境和植物源因素敏感。

为了实现对蜂蜜和蜂花粉中脂质的高效分析，本文提出了一种优化的样品处理流程，随后使用MALDI-TOF MS进行分析。这种方法的优势在于其简便性和高效性。样品处理步骤简单，MALDI-TOF MS能够快速、高通量地分析样品，同时提供样品组成的总体概述。这使得该方法既能生成全局指纹，又能对特定脂质进行有针对性的监测。这种策略支持通过脂质谱对植物源和地理源进行区分，有助于确保产品的原产地真实性。

在实验中，研究人员对多种溶剂和溶剂混合物进行了测试，以确定最佳的提取条件。他们发现，使用六烷醇（hexane:isopropanol，10:1体积比）的混合溶剂能够提供最多的脂质相关信号，并且减少了基质峰的干扰。对于蜂蜜样品，提取步骤包括将750毫克的蜂蜜加入10毫升的离心管中，加入2毫升的六烷醇混合液，使用振动器进行5分钟的混合，然后在室温下以10000转/分钟的速度离心3分钟。而蜂花粉样品的处理则使用99毫克的样品，并通过涡旋混合48秒，随后离心分离。

在MALDI-TOF MS的检测过程中，研究人员对多种基质和离子化剂进行了评估。最终选择2,5-二羟基苯甲酸（DHAP）作为基质，并使用银三氟乙酸盐（AgTFA）作为离子化剂。对于蜂蜜样品，样品、基质和离子化剂的比例为1:1:0.25，而对于蜂花粉样品，该比例调整为1:1:0.5。这些优化条件有助于提高检测的准确性和重复性，同时减少基质峰对脂质信号的干扰。

为了进一步提高方法的准确性，研究人员采用了设计实验（DoE）的方法，对样品处理参数进行了优化。对于蜂蜜样品，使用振动器进行5分钟的提取能够检测到52种脂质，而对于蜂花粉样品，48秒的涡旋处理则能够检测到57种脂质。这些优化后的条件不仅提高了脂质的检测数量，还增强了方法的可重复性和实用性。

通过使用PCA对脂质谱进行分析，研究人员成功地将蜂蜜和蜂花粉样品按其植物源和地理源进行分类。对于蜂蜜样品，所有15个样本均被正确归类，而蜂花粉样品中11个样本也被正确分类。此外，该方法还能够区分同一植物源下的不同地理来源，如在多花粉样本中，根据地理来源的差异，PCA图显示出良好的分离效果。

在方法的绿色和蓝色评估方面，研究人员采用了多种指标，包括绿色分析化学计算器（AGREE）、绿色分析过程指数（MoGAPI）和蓝色适用性等级指数（BAGI）。AGREE评估结果显示，该方法在蜂蜜和蜂花粉中的得分分别为0.66和0.68，均高于绿色的阈值0.6，表明其符合绿色分析化学的原则。MoGAPI进一步评估了方法的环境影响，得出70分的评分，表明其具有中等的环境友好性。而BAGI评估结果显示，该方法得分为75，表明其在实际应用中具有较高的实用性。

总体而言，该研究提出了一种新的方法，用于分析蜂蜜和蜂花粉中的脂质组成，并利用PCA进行分类。该方法不仅具有高效性，还符合绿色分析化学和实用性的要求，为食品欺诈检测提供了新的思路。未来的研究可以进一步扩展该方法的应用范围，以涵盖更多种类的植物源和地理来源的样品，从而提高其在食品溯源和质量控制中的应用价值。