含有5-甲基或5-乙基嘧啶或取代的7-脱氮嘌呤的修饰RNA的酶促合成，以及这些修饰对其稳定性、翻译过程和CRISPR-Cas9切割作用的影响

《ACS Chemical Biology》：Enzymatic Synthesis of Modified RNA Containing 5-Methyl- or 5-Ethylpyrimidines or Substituted 7-Deazapurines and Influence of the Modifications on Stability, Translation, and CRISPR-Cas9 Cleavage

mRNA修饰对翻译效率和CRISPR-Cas9活性影响研究。通过合成5-甲基/乙基尿嘧啶/胞嘧啶和7-脱氮腺苷/鸟苷核苷三磷酸盐，评估了其在体外转录及细胞内外翻译效率、稳定性及CRISPR基因编辑中的作用。结果显示5-甲基尿嘧啶/胞嘧啶可增强体外翻译效率达2倍，而7-脱氮鸟苷在细胞内显著提升翻译速度（3倍于自然mRNA）。但7-脱氮腺苷完全抑制翻译，7-甲基脱氮腺苷导致CRISPR-Cas9切割失效。分子动力学模拟表明，7-甲基脱氮腺苷改变RNA茎环结构，破坏Cas9关键氨基酸相互作用。

　　在现代生物医学研究中，RNA作为一种重要的分子工具，其在基因表达调控、基因编辑和疫苗开发等领域的应用日益广泛。本研究探讨了通过在RNA中引入特定的碱基修饰，对RNA的合成效率、翻译性能以及在CRISPR-Cas9系统中的基因编辑能力的影响。通过合成一系列含有甲基和乙基的5-甲基/乙基嘧啶（尿嘧啶和胞嘧啶）以及7-甲基/乙基/未修饰的7-脱氮嘌呤（如脱氮腺嘌呤和脱氮鸟嘌呤）核苷三磷酸（NTPs），研究人员评估了这些修饰对RNA性能的潜在影响。这些修饰后的NTPs被用于体外转录（IVT）技术，以合成不同长度的RNA，包括模型70-mer RNA、编码Renilla荧光素酶的mRNA和单链引导RNA（sgRNA）。实验结果表明，某些修饰能够提升RNA的翻译效率，而另一些则可能对基因编辑产生不利影响。

### RNA修饰的潜在作用

RNA在细胞内的功能受到其结构和碱基组成的影响。天然RNA中包含多种碱基修饰，这些修饰在RNA的稳定性、翻译效率以及与蛋白质的相互作用中发挥重要作用。例如，mRNA疫苗中引入的N1-甲基假尿嘧啶能够减少免疫反应并提高翻译效率。因此，对RNA中碱基修饰的研究具有重要意义，尤其是在开发新的RNA疗法时。

本研究中，研究人员关注的是在5-位和7-位引入小分子的烷基（甲基和乙基）修饰。在5-位的嘧啶（如尿嘧啶和胞嘧啶）修饰被发现对翻译效率有积极影响，其中5-甲基尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶在体外和细胞内的翻译效率均有所提升。而7-脱氮嘌呤（如脱氮腺嘌呤和脱氮鸟嘌呤）的修饰则表现不同，7-甲基或7-乙基的脱氮腺嘌呤完全抑制了翻译过程，而7-脱氮鸟嘌呤在细胞内的翻译效率显著增强。这一结果表明，碱基修饰的位置和类型对RNA的生物学功能具有显著影响。

### 碱基修饰对翻译效率的影响

在体外翻译实验中，含有5-甲基尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶的mRNA表现出较高的翻译效率。这可能是由于这些修饰改变了RNA的二级结构，从而影响了核糖体的识别和结合。然而，在细胞内的翻译实验中，5-甲基胞嘧啶和5-乙基胞嘧啶的mRNA翻译效率与天然mRNA相似，而5-甲基尿嘧啶的mRNA在早期表现出较高的翻译效率，但随着时间推移，这种优势逐渐减弱。此外，7-脱氮鸟嘌呤的mRNA在细胞内的翻译效率显著提高，尤其是在转染后的早期阶段。这种增强的翻译效率可能与该修饰对核糖体的识别或对翻译起始因子的亲和力有关。

另一方面，含有7-脱氮腺嘌呤的mRNA在体外和细胞内均未表现出翻译活性，这表明7-位的氮原子在翻译过程中可能扮演着关键角色。虽然7-脱氮腺嘌呤的修饰可能在某些情况下不影响RNA的稳定性，但它们似乎无法有效参与翻译过程。这可能与7-脱氮腺嘌呤在RNA结构中的作用有关，例如其可能影响RNA与翻译因子或核糖体的相互作用。

### 7-脱氮鸟嘌呤的特殊表现

7-脱氮鸟嘌呤的mRNA在体外和细胞内均表现出独特的翻译行为。在体外翻译实验中，它并未显示出显著的翻译优势，但在细胞内，它却表现出快速的翻译启动和较高的表达水平。这一现象表明，RNA在细胞内的翻译效率可能受到其结构特性的深刻影响。7-脱氮鸟嘌呤无法形成G四联体或Hoogsteen碱基对，这可能使其在细胞内更易于被核糖体识别和翻译。此外，该修饰可能影响RNA的二级结构，使其在细胞内更稳定或更易于翻译。

然而，这一增强的翻译效率在体外与细胞内表现不一致，这提示我们需要进一步研究其背后的机制。可能的解释包括：7-脱氮鸟嘌呤的修饰改变了RNA的某些结构特性，使其在细胞内更容易被核糖体识别，或者其影响了翻译起始因子的结合效率。此外，RNA在细胞内的环境可能对碱基修饰的翻译效果产生不同的影响，这需要更多的实验来验证。

### CRISPR-Cas9基因编辑中的影响

在CRISPR-Cas9系统中，sgRNA的性能直接影响到基因编辑的效率。本研究中，含有7-脱氮鸟嘌呤的sgRNA在细胞内表现出较高的稳定性，但在基因编辑实验中，它们并未表现出增强的切割效率。相反，含有7-甲基或7-乙基的脱氮腺嘌呤的sgRNA则完全失去了基因编辑能力。这一结果可能表明，这些修饰干扰了Cas9蛋白与sgRNA的结合，从而影响了其切割DNA的能力。

通过分子动力学模拟，研究人员发现，含有7-甲基脱氮腺嘌呤的sgRNA在结构上发生了显著变化，尤其是在茎环结构（Stem Loop 2）区域。这种结构变化导致sgRNA与Cas9蛋白关键残基的接触减少，从而影响了其功能。相比之下，含有7-脱氮鸟嘌呤的sgRNA在结构上保持相对稳定，这可能是其在细胞内表现出较高稳定性的原因。

### 碱基修饰对RNA稳定性的影响

RNA的稳定性在基因治疗和疫苗开发中至关重要。本研究发现，某些碱基修饰能够提高RNA在体外和细胞内的稳定性。例如，含有7-脱氮鸟嘌呤的sgRNA在人类血清中表现出更高的稳定性，而含有7-乙基脱氮腺嘌呤的sgRNA则稳定性较低。这可能与修饰的大小和形状有关，较大的烷基可能干扰RNA的二级结构，从而降低其稳定性。

此外，研究人员还发现，含有5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶的mRNA在体外表现出较高的稳定性，但其在细胞内的稳定性与天然mRNA相似。这表明，碱基修饰对RNA稳定性的影响可能取决于其在细胞内的具体环境。例如，某些修饰可能在体外显著增强RNA的稳定性，但在细胞内由于复杂的相互作用，其效果可能被部分抵消。

### 实验方法与结果分析

为了合成这些碱基修饰的RNA，研究人员使用了体外转录技术，并利用T7 RNA聚合酶作为主要的合成工具。通过改变不同的NTPs，他们成功地合成了多种长度和类型的RNA，包括71-mer的帽化RNA、99-mer的sgRNA和编码Renilla荧光素酶的mRNA。所有合成的RNA都经过了NMR和质谱分析，以确认其结构和纯度。

在翻译效率的评估中，研究人员使用了兔网织红细胞裂解物系统（RRL）和HeLa S3细胞进行实验。结果显示，含有5-甲基尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶的mRNA在体外和细胞内均表现出较高的翻译效率，而含有7-脱氮腺嘌呤的mRNA则完全无法被翻译。此外，含有7-脱氮鸟嘌呤的mRNA在细胞内的翻译效率显著提高，但其在体外的表现并不明显。

在CRISPR-Cas9实验中，研究人员使用了人类血清和PCR技术来评估sgRNA的稳定性。结果表明，含有7-脱氮鸟嘌呤的sgRNA在血清中表现出更高的稳定性，而含有7-甲基或7-乙基脱氮腺嘌呤的sgRNA则表现出较低的稳定性。这可能与修饰的大小和形状有关，较大的烷基可能干扰RNA的结构，从而降低其稳定性。

### 结论与未来研究方向

本研究的结果为RNA碱基修饰的开发提供了重要的见解。在翻译效率方面，某些修饰（如5-甲基尿嘧啶和7-脱氮鸟嘌呤）表现出显著的增强效果，而其他修饰（如7-脱氮腺嘌呤）则完全抑制了翻译。在CRISPR-Cas9基因编辑中，含有7-脱氮腺嘌呤的sgRNA失去了切割能力，而含有7-脱氮鸟嘌呤的sgRNA在结构上保持稳定，但其切割效率未见明显提升。

这些发现强调了碱基修饰在RNA设计中的重要性。未来的研究可以进一步探讨不同修饰在RNA中的位置和作用机制，以优化其在翻译和基因编辑中的表现。此外，研究还可以关注如何通过精确的碱基修饰来提高RNA的稳定性和翻译效率，从而开发更有效的RNA疗法。同时，分子动力学模拟等计算方法可以为理解RNA与蛋白质的相互作用提供重要的理论支持，为RNA工程的进一步发展奠定基础。