利用三维生物打印技术制备的肿瘤球体中，对镉诱导产生的单个癌干细胞进行成像检测

《ACS Applied Materials & Interfaces》：Imaging Sensing of Cadmium-Induced Single Cancer Stem Cells in Tumor Spheroid Fabricated by 3D Bioprinting

本研究利用3D生物打印技术构建肝细胞球模型，探究镉暴露诱导肝癌干细胞（CSCs）形成机制。通过单细胞多色成像技术发现，镉浓度与ALDH1+/CD133+ CSCs比例呈正相关，且在1000 nM时达到22.3%。流式细胞术验证了该结果的可靠性，同时证实3D模型相比传统2D培养更能模拟肿瘤微环境，显著提高CSCs比例（5.7倍）。研究揭示了镉通过激活Hedgehog通路诱导干细胞特性，为环境致癌物研究提供了新方法。

　　本研究探讨了镉对肝癌细胞HepG2在三维生物打印肿瘤球体中的影响，特别是镉如何诱导癌症干细胞（CSCs）的形成及其对治疗抵抗性的影响。通过多色单细胞三维成像技术，研究人员能够直接检测CSCs的生物标志物，而无需将球体从水凝胶中分离出来。这一技术的创新之处在于其能够在保持球体完整性的情况下进行单细胞分析，从而更真实地模拟体内肿瘤微环境（TME），为理解CSCs在癌症治疗失败中的作用提供了有力工具。

### 研究背景

镉是一种广泛存在于工业和日常生活中的重要重金属之一，具有高毒性且容易在体内积累。由于其长半衰期和难以排出的特性，镉的长期暴露对人类健康构成严重威胁。研究表明，镉能够通过替换蛋白质中的红ox活性金属离子，诱导DNA氧化损伤，进而影响DNA修复机制，最终导致癌症细胞的形成。此外，镉还被发现能够促进CSCs的表达，而CSCs作为癌症治疗失败的主要原因，其比例的增加意味着治疗效果的降低和复发风险的上升。因此，能够快速、准确地检测CSCs的存在对于推动癌症研究和临床治疗具有重要意义。

### 材料与方法

研究中使用了HepG2和A549两种癌细胞系，并通过3D生物打印技术在水凝胶中构建了肿瘤球体。水凝胶由海藻酸钠和明胶组成，这些天然来源的材料具有与细胞外基质（ECM）相似的机械和生理特性，为细胞提供了一个接近体内的生长环境。通过CAD软件设计了包含9个微型孔的3D多孔结构，并利用双模式挤出式3D生物打印机将细胞负载的水凝胶打印成交叉形状，以促进球体形成。打印完成后，球体在培养基中进行7天的培养，随后在不同浓度的镉溶液中进行处理，观察其对CSCs形成的影响。

为了检测CSCs，研究人员采用了多色免疫荧光成像技术，标记了ALDH1、CD133、Nanog和Clusterin等CSC生物标志物。通过共聚焦显微镜获取3D图像，并使用IMARIS和MetaMorph等软件对图像进行分析，以确定CSCs的比例和表达水平。此外，为了验证该方法的可靠性，还进行了流式细胞术分析，将球体中的细胞从水凝胶中分离出来，检测其CSC标记物的表达情况。

### 结果分析

研究结果显示，随着镉浓度的增加，CSCs的比例也相应提高。在HepG2球体中，镉处理后，ALDH1和CD133的表达强度显著增强，表明这些细胞具有更强的干细胞特征和治疗抵抗性。特别是，在1000 nM的镉处理下，ALDH1的荧光强度增加了约6.7倍，而CD133的荧光强度则增加了约8.3倍。这一趋势进一步说明了镉对CSCs形成的促进作用。

此外，研究还检测了Nanog和Clusterin的表达情况，发现随着镉浓度的增加，这些生物标志物的表达水平也显著上升。在0 nM镉处理下，Nanog和Clusterin的平均荧光强度分别为12.9和10.3，而在1000 nM镉处理下，它们的平均荧光强度分别达到了91.1和92.9。这些结果表明，镉不仅能够诱导CSCs的形成，还能够增强其干细胞特性，从而提高其在癌症治疗中的生存能力和转移潜力。

### 讨论

研究中采用的3D生物打印和成像技术为CSCs的检测提供了新的视角。与传统的二维细胞培养相比，3D球体更接近体内肿瘤的结构和功能，能够更好地模拟TME的复杂性。例如，HepG2球体在镉处理后，CSCs的比例显著增加，而在二维培养中，这一比例较低。这表明，3D球体能够更真实地反映CSCs在体内环境下的行为和特性。

镉通过激活Hedgehog信号通路，促进CSCs的自我更新和治疗抵抗性。这一通路通过促进转录因子Gli-1的核转位，调节细胞迁移、增殖和存活等关键过程。研究中发现，在三维球体中，Gli-1的核转位比在二维细胞中更为显著，这可能是由于三维结构增强了细胞间的相互作用，从而激活了相关信号通路。这些结果支持了3D球体作为研究CSCs的更优模型的观点。

### 结论

综上所述，本研究通过3D生物打印技术构建了HepG2肿瘤球体，并利用多色单细胞成像技术成功检测了镉诱导的CSCs形成。研究结果表明，随着镉浓度的增加，CSCs的比例和相关生物标志物的表达水平显著上升，说明镉在促进CSCs形成方面具有重要作用。此外，三维球体能够更有效地模拟体内TME，为研究CSCs与致癌物之间的关系提供了可靠的平台。

本研究的意义在于，它不仅揭示了镉对CSCs形成的促进作用，还验证了3D生物打印和成像技术在CSCs检测中的应用价值。该技术能够避免传统方法中对细胞的破坏性处理，提供更真实和可靠的检测结果。对于未来癌症治疗研究而言，这种技术可以为开发针对CSCs的新型治疗策略提供重要的数据支持。同时，研究还指出，镉的暴露途径多种多样，包括空气污染、香烟烟雾和受污染土壤中的农作物，这些都增加了人类接触镉的风险。

通过本研究，科学家们能够更深入地理解镉在促进CSCs形成中的作用，并探索其在癌症治疗中的潜在影响。这一研究不仅为癌症治疗提供了新的思路，也为环境健康风险评估提供了科学依据。未来，随着3D生物打印技术的不断发展和优化，其在癌症研究和治疗中的应用前景将更加广阔。