利用低密度脂蛋白点击化学与纳米粒子对动脉粥样硬化进行靶向PET成像

《Chemical & Biomedical Imaging》：Targeted PET Imaging of Atherosclerosis via Low-Density Lipoprotein Click Chemistry with Nanoparticles

动脉粥样硬化LDL检测采用点击化学策略，利用Ga-68标记氧化铁纳米颗粒特异性成像斑块沉积，通过逆Diels-Alder反应实现高灵敏度低背景，适用于心血管疾病诊断。

　　低密度脂蛋白（LDL）在动脉粥样硬化的形成中扮演着核心角色，因此其检测对于心血管疾病的管理具有重要意义。传统的成像方法在检测LDL沉积方面存在一定的局限性，例如特异性不足以及需要使用半衰期较长的放射性同位素，这增加了辐射暴露的风险并限制了其在临床中的应用。为了解决这些问题，本研究提出了一种基于点击化学的正电子发射断层扫描（PET）成像策略，使用短半衰期的放射性同位素镓-68（⁶⁸Ga）来实现对动脉粥样硬化斑块中LDL沉积的特异性检测。该方法依赖于一种逆电子需求的二烯-二烯狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应，将修饰有顺式环辛烯（TCO）的LDL与携带四氮烯基团的⁶⁸Ga标记的铁氧化物纳米颗粒进行反应。这种方法不仅提高了成像的特异性，还有效降低了辐射剂量，为心血管疾病的早期诊断和风险评估提供了新的工具。

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特点是脂质在动脉壁内积累，导致斑块形成和血管功能障碍。LDL作为血液中主要的胆固醇载体，在这一过程中起着关键作用。高水平的循环LDL会渗入动脉内膜下空间，并经历氧化修饰，形成氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）。oxLDL能够激活内皮细胞，引发炎症反应，并作为单核细胞的趋化因子，促进泡沫细胞的形成，这是动脉粥样硬化早期的一个显著标志。随着时间推移，持续的LDL沉积和免疫细胞的募集会加速斑块的增长和不稳定性，从而增加心肌梗死和中风等心血管事件的风险。鉴于LDL在疾病发生和发展中的核心作用，它不仅是治疗的靶点，还是一种反映动脉粥样硬化负担的分子标志物。

为了更有效地检测LDL的沉积情况，科学家们尝试了多种成像技术。磁共振成像（MRI）可以使用针对oxLDL的造影剂，如LDL模拟物或载体化的纳米颗粒，但其灵敏度较低，需要较高的造影剂浓度才能在体内可视化LDL和相关分子标志物。CT成像结合碘标记的脂质体也已被用于研究LDL的分布，但其对软组织的分辨率较低，限制了其在动脉粥样硬化成像中的应用。光学成像（OI）虽然具有出色的灵敏度，但由于组织穿透能力有限，难以用于深层组织的检测。相比之下，PET成像以其高灵敏度和不受组织穿透限制的优势，成为研究动脉粥样硬化和oxLDL的有力工具。然而，直接对脂蛋白进行放射性标记的方法仍然存在一些挑战，如标记过程的特异性不足以及需要使用长半衰期的放射性同位素。

点击化学技术的出现为解决这些问题提供了新的思路。点击化学是一种快速、高效的化学反应，能够在生理条件下实现对特定分子的精准连接。利用这种技术，研究者可以将预先修饰的生物分子与携带互补反应基团的放射性探针进行反应，从而实现对目标分子的特异性成像。在本研究中，我们选择了一种基于逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应的点击化学策略，利用⁶⁸Ga标记的铁氧化物纳米颗粒（携带四氮烯基团）与修饰有TCO的LDL进行反应。这种方法具有两个关键优势：一是通过TCO连接LDL中的氨基基团，实现对脂蛋白的特异性识别；二是通过微波辅助合成技术，提高纳米颗粒表面四氮烯基团的修饰效率，确保放射性标记的稳定性。

为了验证这一策略的有效性，我们进行了系统的合成和表征实验。首先，我们从健康供体的血浆中分离出LDL，并使用TCO-NHS对其进行修饰，得到LDL-TCO。随后，我们合成了铁氧化物纳米颗粒，并在表面引入四氮烯基团，使其能够与LDL-TCO发生点击反应。在体外实验中，我们通过动态光散射（DLS）技术评估了纳米颗粒和LDL的大小及分散性，确认了它们的物理化学性质符合成像需求。此外，我们还通过荧光光谱分析和点击反应动力学研究，验证了LDL-TCO与四氮烯修饰的纳米颗粒之间的高效结合。这些实验结果表明，该点击化学策略能够在体外条件下实现高效的连接，并且具有良好的稳定性。

在体内实验中，我们使用了LDL受体缺陷型（LDLr^–/–）小鼠作为动脉粥样硬化的模型，并与野生型小鼠进行对比。LDLr^–/–小鼠由于缺乏LDL受体，导致LDL在体内积累，形成明显的动脉粥样硬化斑块。我们首先对LDLr^–/–小鼠进行高胆固醇饮食干预，以促进斑块的形成。随后，我们向这些小鼠注射LDL-TCO，并在24小时后给予⁶⁸Ga标记的四氮烯修饰纳米颗粒。PET/CT成像结果显示，LDLr^–/–小鼠在动脉壁（尤其是主动脉弓、颈动脉和腹主动脉）表现出显著的信号增强，而野生型小鼠则仅在肝脏和脾脏中显示出信号，表明该策略能够特异性地识别动脉粥样硬化斑块中的LDL沉积。这一结果进一步验证了点击化学反应的高效性和特异性。

为了进一步确认点击化学反应的特异性，我们还进行了体外实验。通过将LDL-TCO与未携带四氮烯基团的⁶⁸Ga标记纳米颗粒进行反应，我们发现没有明显的动脉信号，说明信号的增强是由于点击反应的特异性连接所致。此外，我们还通过放射性计数和组织学分析对体内分布进行了评估。结果表明，⁶⁸Ga标记的纳米颗粒在肝脏和脾脏中表现出显著的积累，而在动脉壁中则显示出更高的特异性。组织学分析使用普鲁士蓝染色法检测铁含量，进一步验证了纳米颗粒在动脉壁中的沉积情况。LDLr^–/–小鼠的主动脉切片显示出明显的蓝色沉积，而野生型小鼠则没有检测到信号，这表明该策略能够准确地反映LDL在动脉粥样硬化斑块中的沉积情况。

本研究的创新之处在于利用点击化学技术实现了对LDL沉积的高特异性成像，同时避免了传统放射性标记方法的不足。这种方法不仅提高了成像的准确性，还显著降低了辐射暴露，为临床应用提供了更安全的选项。此外，该策略具有良好的可扩展性，可以应用于其他长循环生物标志物的检测。未来的研究方向将包括优化点击化学组分的药代动力学特性，扩展该方法至其他脂蛋白类别（如高密度脂蛋白，HDL），并将其应用于更大动物模型以评估其临床可行性。同时，为了推动该技术的临床转化，还需要在符合药品生产质量管理规范（GMP）的条件下进行大规模合成，并验证其稳定性和可重复性。

综上所述，本研究提出了一种基于点击化学的PET成像策略，能够特异性地检测动脉粥样硬化斑块中的LDL沉积。该方法利用⁶⁸Ga标记的铁氧化物纳米颗粒与TCO修饰的LDL之间的逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应，实现了对LDL的高效识别和可视化。这种方法不仅提高了成像的特异性，还有效降低了辐射剂量，为心血管疾病的早期诊断和风险评估提供了新的工具。此外，该策略的可扩展性和临床适用性为未来研究和应用奠定了坚实的基础，有望在心血管成像领域发挥重要作用。