由原代肝细胞3D生物打印而成的肝癌模型，用于模拟癌症发生过程及药物筛选

《Hepatology Communications》：3D-bioprinted liver cancer models derived from primary hepatocytes for simulating cancer initiation and drug screening

肝细胞癌早期模型构建及药物响应分析。通过引入不同致癌基因组合至原代小鼠肝细胞，结合3D生物打印技术，成功建立三维肿瘤组织模型。研究显示RAS驱动细胞对铁死亡诱导剂RSL3敏感性最高（IC50=1.521μM），而c-Myc/Hras组合呈现显著化疗和靶向药物耐药性（DOX IC50=3.37μM， sorafenib IC50=36.94μM）。三维模型较二维培养细胞存活率降低23%-45%，且具有更强的肿瘤微环境模拟特性。脂质过氧化标志物MDA在shp53+Hras组中升高2.3倍，Ki67表达量增加40%-60%。该模型为解析HCC早期发病机制及开发精准疗法提供了重要工具。

　　肝癌是全球范围内最致命的癌症之一，尤其是肝细胞癌（HCC）在所有肝癌病例中占据主导地位，占约90%。由于HCC的高致死率，研究其早期发生机制对于开发早期诊断策略和预防性治疗至关重要。然而，当前在体外模拟HCC早期演变过程的模型仍存在诸多挑战，主要体现在如何准确再现肿瘤的复杂结构和生物学特性。为此，科学家们开发了一种新的研究方法，通过引入不同的癌基因组合到原始小鼠肝细胞中，结合3D生物打印技术，构建出更接近真实肿瘤组织的模型，从而更好地模拟HCC的早期特征。

### 研究方法

研究人员首先通过一种两步的原位灌注方法，从6至8周龄的小鼠中分离出原始肝细胞。这种方法不仅能够高效地获取肝细胞，还能在体外维持其成熟的功能。随后，他们利用特定的癌基因（如c-Myc、Hras、β-catenin、shp53、c-Met等）对这些肝细胞进行基因改造，通过病毒载体将这些癌基因导入细胞中。改造后的细胞经过单细胞分选和扩增，形成了六种不同基因组合的肝癌细胞系。这些细胞不仅保留了肝细胞的原始功能，还表现出肿瘤细胞的特征，如异常的细胞形态、增强的干细胞相关基因表达以及对特定药物的敏感性变化。

为了进一步模拟肿瘤微环境，研究人员使用了3D生物打印技术。他们将细胞悬浮液与由明胶和海藻酸钠组成的生物墨水混合，并通过3D细胞打印机构建出具有多层结构的肿瘤组织模型。这些模型具有独立的孔隙结构，有助于细胞与培养基的充分接触。为了增强模型的结构稳定性，生物墨水在打印后通过钙离子交联处理。随后，模型在特定的培养基中进行长期培养，以维持其结构和功能特性。

### 研究结果

在功能检测方面，研究人员发现这些改造后的肝细胞在体外表现出与正常肝细胞不同的特性。例如，它们能够有效吸收和释放吲哚菁绿（ICG），并且能够储存糖原，这些都表明它们在功能上保留了肝细胞的某些特性。同时，通过qPCR分析，研究人员还发现这些细胞在特定基因表达方面发生了显著变化，如肝功能相关基因（如Alb、Ttr、Cyp3a11等）的表达水平下降，而干细胞相关基因（如Sox9、Axin2）的表达则显著上升。

在对癌基因改造后的细胞进行药物敏感性测试时，研究人员发现不同的癌基因组合导致了不同的药物反应。特别是携带Hras突变的细胞表现出对铁死亡（ferroptosis）的高度敏感性。铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化引起的细胞死亡形式，被认为是癌症治疗中的一个重要机制。通过使用RSL3作为铁死亡诱导剂，研究人员发现携带shp53和Hras突变的细胞对RSL3的敏感性最高，这表明针对这些突变的患者，铁死亡诱导治疗可能具有显著的临床应用价值。

此外，研究人员还测试了多种化疗药物和靶向药物对不同癌基因改造细胞的敏感性。结果显示，携带shp53突变的细胞对多柔比星（DOX）表现出更高的敏感性，而携带c-Myc和Hras突变的细胞则对靶向药物（如索拉非尼、仑伐替尼和卡博替尼）表现出更强的耐药性。这些发现揭示了不同癌基因组合在药物反应上的异质性，为个体化治疗策略的制定提供了理论依据。

为了进一步验证这些模型的生理相关性，研究人员还比较了2D培养和3D生物打印模型在药物反应上的差异。结果显示，3D模型在药物耐受性方面表现出显著的增强，尤其是在化疗药物和靶向药物方面。这种增强的耐受性可能与3D环境中细胞的增殖能力增强以及干细胞相关基因的高表达有关。因此，3D生物打印模型在模拟肿瘤微环境和药物反应方面具有更高的准确性，为药物筛选和机制研究提供了更可靠的平台。

### 研究意义

本研究的成果对于肝癌的研究和治疗具有重要意义。首先，通过构建不同癌基因组合的肝癌细胞系，研究人员能够更精确地模拟HCC的早期发生过程，为理解肝癌的分子机制提供了新的工具。其次，3D生物打印模型的建立使得研究者能够在更接近体内环境的条件下评估药物效果，从而提高药物筛选的准确性。这种方法不仅能够更好地再现肿瘤的结构特征，还能模拟肿瘤微环境中的复杂相互作用，为个性化医疗和精准治疗提供了新的方向。

此外，本研究还揭示了不同癌基因组合在药物反应上的差异，这有助于开发针对特定基因突变的靶向治疗策略。例如，携带Hras突变的细胞对铁死亡诱导剂表现出更高的敏感性，这为未来开发基于铁死亡机制的抗癌药物提供了新的思路。同时，3D模型在药物耐受性方面的表现也表明，传统的2D模型可能无法充分反映肿瘤在体内的真实药物反应，因此，3D模型在临床前研究中的应用前景广阔。

### 未来展望

尽管本研究取得了一定的成果，但仍然存在一些局限性。例如，当前的研究主要基于小鼠模型，而将这些发现应用于人类肝癌仍需进一步验证。未来的研究可以考虑引入患者来源的肝癌细胞，并结合肿瘤微环境的成分，以构建更具临床意义的模型。此外，随着生物打印技术的不断发展，研究人员还可以探索更多复杂的结构和功能，以更全面地模拟肝癌的生物学特性。这些进展将有助于推动肝癌的精准治疗和新药开发，为患者带来更好的治疗选择和预后。

总之，本研究通过引入不同的癌基因组合到原始肝细胞中，并利用3D生物打印技术构建出更精确的肝癌组织模型，为理解HCC的早期发生机制和开发新的治疗策略提供了重要的基础。这些模型不仅在药物反应方面表现出更高的准确性，还能够模拟肿瘤微环境的复杂性，为肝癌的体外研究和临床转化提供了新的工具和方法。