在二维培养环境中，肝细胞的去分化现象揭示了广泛的转录组与蛋白质组重编程

《Hepatology Communications》：Hepatocyte dedifferentiation in 2D culture reveals extensive transcriptomic and proteomic rewiring

肝细胞体外培养24小时后，其转录组和蛋白质组均发生显著重编程。研究发现超过10,000个基因和3,000个蛋白质表达水平改变，导致转录异质性降低及肝组织区室化标志物丢失。蛋白质组分析显示细胞外基质、线粒体和核糖体相关蛋白丰度显著变化，并出现急性期反应蛋白和抗氧化蛋白上调。单细胞RNA测序证实培养肝细胞异质性降低，且包含去分化的内皮细胞亚群。研究开发Hepamorphosis交互式工具，整合转录组、蛋白质组和单细胞数据，揭示体外培养对肝细胞功能的影响及分子机制。

　　肝细胞在体外培养过程中会发生显著的转录组和蛋白质组变化，这些变化可能影响其在研究肝脏生理和分子机制中的应用价值。本研究通过比较完整肝脏组织与原代肝细胞在新鲜分离和24小时二维培养后的转录组和蛋白质组特征，揭示了培养对肝细胞功能的影响，并开发了一个名为“Hepamorphosis”的交互式应用，以便研究者更全面地探索这些数据。

肝脏是维持机体血糖和脂质平衡的核心器官，其功能异常可能导致代谢相关脂肪肝疾病（MAFLD）。肝细胞约占肝脏质量的80%以上，承担着合成血浆蛋白、糖异生、脂质代谢、胆汁酸合成和解毒等多种关键功能。这些功能在肝脏的结构中具有空间组织特性，例如靠近门静脉区的肝细胞主要执行β-氧化和糖异生，而靠近中央静脉区的肝细胞则参与糖酵解、甘油三酯合成、脂生成和酮体生成。某些基因如Cyp2f2和Glul在门静脉和中央静脉周围表达，进一步表明了肝细胞的空间分布对其功能的重要性。单细胞RNA测序的研究已经揭示了肝脏中9个区域的基因表达模式，这些模式也在蛋白质水平上得到了验证。

然而，将肝细胞用于体外研究时，其功能可能会受到干扰。原代肝细胞，尤其是来自人类的肝细胞，是研究肝脏功能的重要工具。在啮齿类动物中，常用的肝细胞分离方法是两步胶原酶消化法，该方法涉及使用无钙胶原酶缓冲液进行灌注，随后将细胞播种在胶原蛋白上。尽管啮齿类肝细胞更容易获得，并保留了糖异生和尿素生成等关键功能，但它们在培养过程中会发生去分化现象。例如，有研究发现人类肝细胞在仅3天的培养后就会出现形态学变化，另一项研究则表明随时间推移，差异表达的蛋白质数量会增加。

在之前的研究中，我们比较了完整肝脏组织和培养的肝细胞的转录组，发现存在显著变化，这表明在培养过程中肝细胞发生了去分化。然而，该研究有两个局限性：首先，批量RNA测序无法区分这些变化是否由去分化引起还是由于细胞组成的变化；其次，mRNA和蛋白质水平之间往往缺乏一致性，这限制了我们对功能影响的判断。为了解决这些问题，我们扩展了批量RNA测序分析，并重复了肝细胞的分离和培养过程，同时使用蛋白质组学和单核RNA测序（snRNAseq）技术对样本进行了分析。这种整合方法使我们能够将转录组变化归因于特定的细胞类型，并评估分离和培养对肝细胞蛋白质组的影响。

研究结果表明，24小时的二维培养会导致超过10,000个基因和3,000个蛋白质发生显著变化，伴随转录异质性的减少和区域标记物的丢失。此外，与细胞外基质（ECM）相关的蛋白质、线粒体和核糖体蛋白的丰度也发生了变化，同时急性相反应蛋白的表达增加。这些变化提示，培养过程对肝细胞的分子特性产生了深远影响，可能限制其在模拟肝脏生理功能中的应用。

进一步分析显示，尽管在培养过程中肝细胞的某些功能如蛋白酶活性似乎保持稳定，但其整体的转录组和蛋白质组都经历了显著的重塑。这包括线粒体相关基因的表达减少，而核糖体和细胞骨架相关基因的表达增加。线粒体蛋白的丰度反而增加，这一现象与之前的转录组数据和部分研究结果存在矛盾，提示可能存在转录后调控或mRNA与蛋白质水平变化不同步的情况。同时，研究发现，培养的肝细胞中存在部分去分化的内皮细胞，这些细胞在培养过程中表现出与肝脏和细胞悬浮液中的内皮细胞不同的转录特征。

在蛋白质层面，培养的肝细胞表现出更高的氧化应激相关蛋白和急性相反应蛋白的丰度，表明其可能处于一种应激状态。此外，葡萄糖转运蛋白的表达也发生了变化，如Glut1在培养的肝细胞中高表达，而Glut2在完整肝脏组织中更为常见。这种变化可能反映了肝细胞在培养环境中的代谢适应。

为了便于数据探索，我们开发了一个名为“Hepamorphosis”的交互式仪表盘，它提供了三种模块：基因探索器、相关性分析器和区域分析器。这些模块可以帮助研究人员在转录组和蛋白质组水平上更全面地理解肝细胞培养后的变化。通过该应用，用户可以可视化基因表达、比较蛋白质丰度，并分析不同细胞类型之间的基因表达差异。

综上所述，原代肝细胞在培养过程中经历了显著的转录组和蛋白质组的重塑，这种变化可能导致其功能特征的改变。尽管某些功能如蛋白酶活性仍然保持稳定，但培养过程对肝细胞的分子特性产生了深远影响。这些发现强调了在使用体外培养的肝细胞进行研究时，需要考虑其去分化和功能变化的可能性。同时，我们的研究也为进一步探索肝细胞培养的优化方法提供了新的视角。