法医唾液鉴定中核酸共提取方法的评估：miRNA回收效率与试剂盒选择策略

《International Journal of Legal Medicine》：Evaluation of extraction methods for co-isolation of nucleic acid from human saliva for forensic body fluid identification

本研究针对法医体液鉴定中miRNA标志物研究可重复性差的问题，系统评估了三种核酸提取试剂盒（AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit、QIAamp DNA Mini Kit和miRNeasy Tissue/Cells Advanced Micro Kit）对不同体积唾液样本（400μL至25μL）中DNA、RNA和miRNA共提取效率的影响。结果表明，专门设计的DNA提取试剂盒在miRNA回收率和检测灵敏度方面反而优于专用miRNA提取试剂盒，为法医体液鉴定中核酸提取方法的标准化提供了重要实验依据。

　　

在犯罪现场调查中，体液鉴定（BFID）是重建案发现场和确定生物材料来源的关键环节。传统上，法医科学家依赖血清学测试来识别血液、唾液、精液等体液，但这些方法存在灵敏度低、特异性差、样本消耗大等局限性。随着分子生物学技术的发展，微RNA（miRNA）作为一种新型生物标志物逐渐展现出巨大潜力——这些长度仅18-24个核苷酸的小分子RNA具有组织特异性表达、高丰度和卓越稳定性等特点，特别适用于降解严重的法医样本。

然而，尽管已有大量研究探索miRNA在体液鉴定中的应用，不同研究团队报道的标志物却很少重叠，导致结果缺乏可重复性。这种不一致性很大程度上源于各实验室使用的核酸提取方法存在差异。由于miRNA分析是一个多步骤过程，包括核酸提取、cDNA合成和qPCR分析等环节，其中提取方法的选择可能显著影响miRNA的回收效率和检测结果。正如此前Zubakov等人无法重复Hanson团队的研究结果，他们将此归因于技术方法的差异。

针对这一方法学挑战，Anglia Ruskin大学和剑桥大学的研究团队在《International Journal of Legal Medicine》上发表了一项创新性研究，系统评估了三种常用核酸提取试剂盒对唾液中核酸共提取效率的影响，特别关注了不同样本体积下的miRNA回收情况。该研究为法医体液鉴定中核酸提取方法的标准化提供了重要实验证据。

关键技术方法概述

研究团队收集了三名健康志愿者的唾液样本，混合后分成五种体积（400μL、200μL、100μL、50μL和25μL），分别使用三种商业化试剂盒（两种DNA提取试剂盒和一种miRNA专用提取试剂盒）进行核酸共提取。通过NanoDrop和Qubit两种平台评估核酸产量和纯度，并采用两步法RT-qPCR分析唾液特异性miRNA（miR-205和miR-203）及内参基因（RNU44、RNU48和RNU6b）的表达水平。统计分析方法包括线性回归、变异系数（CV%）计算和Friedman检验等。

DNA提取效率评估

研究结果显示，不同试剂盒在DNA提取效率方面存在显著差异。AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit（基因组试剂盒）在所有样本体积中均产生最高的DNA产量，在400μL样本体积下达到47.70 ng/μL，且表现出高灵敏度（R²=0.9990）。然而，该试剂盒的DNA纯度存在变异性（A_260nm/A_280nm比值范围为1.49-2.76）。QIAamp DNA Mini Kit产量中等但纯度更稳定，而miRNeasy Tissue/Cells Advanced Micro Kit在纯度方面表现最佳但DNA产量中等。

RNA提取效率评估

在RNA提取方面，基因组试剂盒同样表现出色，在400μL样本体积下RNA产量达38.20 ng/μL，且灵敏度极高（R²=0.9992）。QIAamp试剂盒产量较低但纯度良好，而miRNeasy试剂盒在中等样本体积下产量波动较大，灵敏度相对较低（R²=0.6029）。

miRNA提取效率评估

最令人意外的发现来自miRNA提取评估。专门为miRNA提取设计的miRNeasy试剂盒表现最差，在大多数样本体积下产量极低（25μL时仅2.74 ng/mL）。相反，基因组试剂盒在miRNA产量方面表现最佳，在400μL时达701.0 ng/mL，且灵敏度极高（R²=0.9980）。QIAamp试剂盒产量中等但一致性较差。

miRNA和内参基因表达水平

RT-qPCR分析进一步证实了上述结果。基因组试剂盒在所有靶标中均呈现最低的Cq值（miR-205为26，miR-203为25），表明其检测灵敏度最高。QIAamp试剂盒表现中等，而miRNeasy试剂盒对miR-203的检测效率最低（Cq=29.58）。值得注意的是，不同miRNA对提取方法的敏感性存在差异——miR-205和RNU6b的表达水平受提取方法影响较小，而miR-203、RNU44和RNU48则对提取方法更为敏感。

研究结论与意义

这项研究揭示了核酸提取方法选择对法医体液鉴定结果可靠性的关键影响。出乎意料的是，专门为miRNA提取设计的试剂盒并未表现出优势，而常规DNA提取试剂盒在miRNA回收效率方面反而更优。这一发现挑战了"专用试剂盒必然更适合特定应用"的传统观念，提示在法医科学领域需根据实际样本特点优化提取方案。

研究的实际意义在于为法医实验室提供了明确的试剂盒选择依据：当样本量充足时，AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit可实现高效的核酸共提取；而对于微量样本，QIAamp DNA Mini Kit可能是更可靠的选择。此外，研究强调了对miRNA标志物进行方法学验证的必要性，因为不同miRNA对提取方法的敏感性存在显著差异。

该研究的局限性包括仅关注了唾液样本，且样本量较小。未来研究可扩展至其他法医相关体液（如血液、精液等），并纳入更多样本和提取方法进行比较。尽管如此，这项研究为法医体液鉴定中miRNA分析方法的标准化迈出了重要一步，有助于提高不同实验室间结果的可比性和可重复性，最终增强miRNA标志物在法庭科学中的可靠性和证据价值。