应用MLPA-NGS技术精准定位VHL综合征家系生殖系缺失突变的研究

《BMC Medical Genomics》：Identification of a VHL germline deletion in a family with Von Hippel-Lindau syndrome using MLPA-NGS

本研究针对VHL综合征家系中传统全外显子测序(WES)难以检测小片段缺失的局限性，采用MLPA-NGS技术结合Sanger测序，成功鉴定出VHL基因外显子2-3区段6,662 bp的生殖系缺失，并精确解析其断裂点位于Alu重复序列内。该研究为VHL综合征的分子诊断提供了高精度技术方案，对遗传咨询和家族筛查具有重要意义。

　　

在遗传性肿瘤综合征中，Von Hippel-Lindau综合征(VHL)以其多器官肿瘤发生特征而备受关注。这种常染色体显性遗传病主要由VHL基因突变引起，患者常在视网膜、中枢神经系统、肾脏等部位发生血管母细胞瘤和肾细胞癌。然而，临床诊断面临着一个关键挑战：约11%的VHL病例由大片段缺失引起，而传统的全外显子测序(WES)对小于100 kb的拷贝数变异(CNV)检测灵敏度有限，导致部分患者无法获得明确分子诊断。

面对这一技术瓶颈，上海交通大学医学院附属儿童医院的研究团队在《BMC Medical Genomics》发表了创新性研究。他们在一个具有典型VHL症状的家族中，先证者虽经WES检测发现VHL基因存在变异，但其儿子的检测结果却呈阴性，这与疾病的常染色体显性遗传模式明显不符。这一矛盾结果促使研究人员转向更精准的检测技术——多重连接依赖性探针扩增-下一代测序(MLPA-NGS)。

研究团队采用了一种渐进式探针设计策略，通过三轮探针密度递增逐步逼近断裂点区域。第一轮探针确认了外显子2-3的杂合缺失，第二轮探针将断裂点范围缩小至约1,500 bp，第三轮探针进一步将理论扩增片段控制在1,468 bp以内。这种精妙的设计使得后续的Sanger测序能够成功定位精确断裂点。

技术方法上，本研究主要运用了MLPA-NGS技术进行CNV筛查，结合基因芯片分析排除大片段变异，最后通过Sanger测序进行断裂点验证。样本来源于VHL综合征家系成员（先证者、其儿子和丈夫）及健康对照，均来自上海儿童医院。

基因芯片分析

基因芯片结果显示，在先证者家族成员中，染色体3及VHL基因附近未发现大于1 Mb的拷贝数变异，提示可能存在的缺失片段小于芯片检测下限。

MLPA-NGS分析

通过三轮探针检测，研究人员在先证者及其儿子中均发现VHL基因外显子2-3区域存在杂合缺失，而其他区域拷贝数正常。探针信号的梯度变化清晰展示了缺失区域边界，为后续精确定位奠定基础。

Sanger分析

最终测序结果显示，断裂点精确位于染色体3的10,145,434和10,152,097位置(GRCh38/hg38)，确认缺失片段长度为6,662 bp。进一步分析发现，这两个断裂点分别位于AluY和AluSx重复元件内，符合Alu介导的同源重组机制特征。

这项研究的重要意义在于建立了MLPA-NGS技术检测小片段CNV的标准化流程，成功解决了WES在VHL综合征诊断中的技术盲区。该方法不仅提高了检测精度，还通过迭代探针设计实现了断裂点的精确定位，为遗传咨询和产前诊断提供了可靠依据。特别值得注意的是，本研究发现的断裂点位于Alu重复序列内，为理解VHL基因缺失的分子机制提供了新证据，同时这一特异性断裂点也可作为该家系的遗传标记用于家族成员筛查。

从技术发展角度看，MLPA-NGS结合了MLPA的特异性和NGS的高通量优势，克服了传统MLPA依赖毛细管电泳的局限性，使检测通量显著提升。随着测序成本降低，这一技术有望成为临床CNV检测的新标准。对于VHL综合征患者而言，准确的基因诊断不仅关系到疾病管理，还对肿瘤预防和家族遗传风险评估具有重要指导价值。